pcr-rflp

1、【實(shí)驗(yàn)原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件在體外酶促合成特異DNA片段的循環(huán)反應(yīng)，可使目的DNA片段得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板DNA置于高溫(約93℃95℃)下使之變性解鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫(約50℃70℃)下分別與目的DNA片段兩側(cè)的互補(bǔ)序列復(fù)性結(jié)合；引物在DNA聚合酶作用（約70℃75℃）下沿模板按5’→3’方向延伸，合成目的DNA片段的新互補(bǔ)鏈。如此經(jīng)過(guò)n個(gè)周期，理論上擴(kuò)增2n倍一

2、般PCR經(jīng)3040周期后可獲得百萬(wàn)倍以上的目的DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)（PCR—RFLP）分析技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。DNA堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，使酶切位點(diǎn)增加或者消失，利用這一酶切性質(zhì)的改變，PCR特異擴(kuò)增包含堿基置換的這段DNA，經(jīng)某一限制酶切割，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較來(lái)確定是否變異。應(yīng)用PCR—RFLP，可檢測(cè)某一致病基因已知的點(diǎn)突變，進(jìn)行直接基因診斷，也

3、可以此為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析進(jìn)行間接基因診斷。本實(shí)驗(yàn)以家族性甲型血友病患者及其相關(guān)成員外周血DNA為模板，PCR擴(kuò)增凝血因子FⅧ基因的583bp特異片段產(chǎn)物，其中包含MspⅠRFLP多態(tài)位點(diǎn)，經(jīng)MspⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)等位片段的長(zhǎng)度（583bp或360bp223bp），以此為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，判斷胎兒是否得到了帶有缺陷FⅧ基因的染色體，從而做出間接基因診斷。【實(shí)驗(yàn)用品】1DNA（50ngμl）、引物Ⅰ和Ⅱ（20μΜ）、Ta

4、qDNA聚合酶（5Uμl）10PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP（2.5mM）、滅菌蒸餾水、液體石蠟、限制性內(nèi)切酶MspⅠ（20Uμl）、10酶切緩沖液。22%的瓊脂糖凝膠、5TAE、6上樣緩沖液、DNAMarker、溴化乙啶貯存液（10mgml）（EB）。3PCR自動(dòng)熱循環(huán)儀、紫外透射儀、微量加樣器（20μl、200μl）、槍頭（20μl、200μl）及離心管(1ml、0.5ml)、容器盒、恒溫水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、燒杯、保鮮膜、封口膜

5、、浮漂、微波爐、250ml三角燒瓶、透明膠帶、托盤(pán)天平、臺(tái)式高速離心機(jī)?！緦?shí)驗(yàn)步驟】一PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系20μl，其成分如下：按以上次序，將各物質(zhì)加入到一只無(wú)菌的0.5ml離心管中。輕輕混勻后，離心5秒鐘，加入一滴液體石蠟蓋于反應(yīng)混合液的表面，然后放入PCR儀中進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。PCR反應(yīng)循環(huán)溫度：94℃預(yù)變性3分鐘，然后進(jìn)行以下循環(huán)30次最后經(jīng)72℃再充分延伸7分鐘。反應(yīng)結(jié)束后置4℃冰箱保存。二PCR產(chǎn)物的MspⅠ酶切反應(yīng)體系20μ

6、l其成分如下：置37℃水浴消化1小時(shí)，4℃保存。三瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)1膠板的準(zhǔn)備取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈晾干。取透明膠帶將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（注意，將透明膠帶緊貼于有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊上，不要留空隙）。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置，在距離底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。22%的瓊脂糖凝膠的制備稱(chēng)取1克瓊脂糖，置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入50ml1TAE，瓶口用保鮮膜封蓋，在微波爐中加熱直至瓊脂糖全部溶解，得到2%瓊脂糖凝膠液，待其冷卻至

7、65℃左右，加入2.5μl溴化乙啶貯存液（10mgml），使溴化乙啶終濃度為0.5μgml。小心混勻并倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽中，控制灌膠速度，使膠液緩慢展開(kāi)，避免產(chǎn)生氣泡，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置1小時(shí)左右，待膠凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開(kāi)的樣品槽。3將凝膠放入電泳槽中，加入恰好沒(méi)過(guò)膠面1mm深的足夠電泳緩沖液，預(yù)電泳10min。4每份限制酶切產(chǎn)物取10μl，加2μl6上樣緩沖液，混勻后加入到樣品