基于線粒體12S rRNA基因的PCR-RFLP鑒別混合牛肉及制品的牛種來源研究.pdf

1、線粒體基因組具有種內高度保守性，同時具有很強的抗腐蝕性，其上的12SrRNA基因更具抗腐蝕、耐高溫的特點，在國內外被逐漸用于飼料、鮮肉及肉制品的來源追蹤和物種成分鑒別等研究。 本研究用牦牛、黃牛、水牛作為研究材料，根據食品加工特點，把樣品分為新鮮樣品和加工模擬組樣品。加工模擬組樣品進行溫度梯度處理(100℃、120℃、140℃、160℃、180℃)研究不同溫度下對鑒別的影響。針對不同的樣品處理方式采取相應的DNA提取方法提取DN

2、A。對部分新鮮樣品組DNA采用連續(xù)稀釋的辦法，使DNA濃度達到相當于實際樣品含量的1％，0.1％，0.01％，0.001％，確定鑒別的最低DNA模板濃度。 設計引物P1擴增真核生物共有的137bp長度的18SrDNA基因片段作為內源參照驗證加工樣品提取DNA模板質量的有效性；設計通用引物P2擴增牦牛、黃牛、水牛線粒體12SrRNA基因片段，擴增片段大小為453bp(黃牛452bp)，在擴增片段區(qū)域尋找牦牛、黃牛、水牛各自不同的特

3、異的酶切位點。通過測序驗證酶切位點的正確性。建立了鑒別牦牛、黃牛、水牛的PCR-RFLP分析方法，可用于混合鮮牛肉及制品的牛種來源的鑒別。 對分別來自四川、甘肅、云南、陜西、安徽、廣東、湖北的2個牦牛品種，8個黃牛品種，4個水牛品種，每個品種采集肌肉樣30個，共420個，用該方法分別進行鑒別分析，設計的引物均能擴增出相應PCR產物。對擴增產物用BspHⅠ、EcoNⅠ、HpaⅡ進行酶切，并進行測序驗證，結果如下： 牦牛12

4、SrRNA基因片段被酶切為203bp和250bp，黃牛12SrRNA基因片段被酶切為134bp和318bp，水牛12SrRNA基因片段被酶切為86bp和367bp，沒有交叉酶切現象，通過測序驗證了特異性位點和酶切的正確性。 經過對樣品經過不同溫度處理(100℃、120℃、140℃、160℃、180℃)后發(fā)現在不同溫度處理下均能擴增目的條帶，但條帶從120℃開始變淡。 在優(yōu)化PCR反應條件情況下，DNA模板濃度在0.01％

5、時，牦牛12SrRNA基因片段酶切條帶幾乎不可見，得出酶切鑒別的最低DNA模板濃度要求為0.01％。 用本研究建立的方法對分別購自雅安、康定、成都超市的24個品牌的牦牛肉干制品進行鑒別，發(fā)現僅有3個品牌是牦牛肉，剩余的其中6個品牌是黃牛制品，4個品牌是水牛制品。除此之外的為其它的肉制品。說明牛肉干市場上用黃牛、水牛甚至其它的肉冒充牦牛干制品的現象非常嚴重。 本研究建立的方法是國內首創(chuàng)的可以快速檢測牛肉制品中的牦牛、黃牛、