基于線粒體12S rRNA基因的PCR-RFLP鑒別混合牛肉及制品的牛種來源研究.pdf

1、線粒體基因組具有種內(nèi)高度保守性，同時(shí)具有很強(qiáng)的抗腐蝕性，其上的12SrRNA基因更具抗腐蝕、耐高溫的特點(diǎn)，在國內(nèi)外被逐漸用于飼料、鮮肉及肉制品的來源追蹤和物種成分鑒別等研究。 本研究用牦牛、黃牛、水牛作為研究材料，根據(jù)食品加工特點(diǎn)，把樣品分為新鮮樣品和加工模擬組樣品。加工模擬組樣品進(jìn)行溫度梯度處理(100℃、120℃、140℃、160℃、180℃)研究不同溫度下對(duì)鑒別的影響。針對(duì)不同的樣品處理方式采取相應(yīng)的DNA提取方法提取DN

2、A。對(duì)部分新鮮樣品組DNA采用連續(xù)稀釋的辦法，使DNA濃度達(dá)到相當(dāng)于實(shí)際樣品含量的1％，0.1％，0.01％，0.001％，確定鑒別的最低DNA模板濃度。 設(shè)計(jì)引物P1擴(kuò)增真核生物共有的137bp長度的18SrDNA基因片段作為內(nèi)源參照驗(yàn)證加工樣品提取DNA模板質(zhì)量的有效性；設(shè)計(jì)通用引物P2擴(kuò)增牦牛、黃牛、水牛線粒體12SrRNA基因片段，擴(kuò)增片段大小為453bp(黃牛452bp)，在擴(kuò)增片段區(qū)域?qū)ふ谊笈?、黃牛、水牛各自不同的特

3、異的酶切位點(diǎn)。通過測序驗(yàn)證酶切位點(diǎn)的正確性。建立了鑒別牦牛、黃牛、水牛的PCR-RFLP分析方法，可用于混合鮮牛肉及制品的牛種來源的鑒別。 對(duì)分別來自四川、甘肅、云南、陜西、安徽、廣東、湖北的2個(gè)牦牛品種，8個(gè)黃牛品種，4個(gè)水牛品種，每個(gè)品種采集肌肉樣30個(gè)，共420個(gè)，用該方法分別進(jìn)行鑒別分析，設(shè)計(jì)的引物均能擴(kuò)增出相應(yīng)PCR產(chǎn)物。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用BspHⅠ、EcoNⅠ、HpaⅡ進(jìn)行酶切，并進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果如下： 牦牛12

4、SrRNA基因片段被酶切為203bp和250bp，黃牛12SrRNA基因片段被酶切為134bp和318bp，水牛12SrRNA基因片段被酶切為86bp和367bp，沒有交叉酶切現(xiàn)象，通過測序驗(yàn)證了特異性位點(diǎn)和酶切的正確性。 經(jīng)過對(duì)樣品經(jīng)過不同溫度處理(100℃、120℃、140℃、160℃、180℃)后發(fā)現(xiàn)在不同溫度處理下均能擴(kuò)增目的條帶，但條帶從120℃開始變淡。 在優(yōu)化PCR反應(yīng)條件情況下，DNA模板濃度在0.01％

5、時(shí)，牦牛12SrRNA基因片段酶切條帶幾乎不可見，得出酶切鑒別的最低DNA模板濃度要求為0.01％。 用本研究建立的方法對(duì)分別購自雅安、康定、成都超市的24個(gè)品牌的牦牛肉干制品進(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn)僅有3個(gè)品牌是牦牛肉，剩余的其中6個(gè)品牌是黃牛制品，4個(gè)品牌是水牛制品。除此之外的為其它的肉制品。說明牛肉干市場上用黃牛、水牛甚至其它的肉冒充牦牛干制品的現(xiàn)象非常嚴(yán)重。 本研究建立的方法是國內(nèi)首創(chuàng)的可以快速檢測牛肉制品中的牦牛、黃牛、