山羊三種病原行性研究與PCR-RFLP分析.pdf

1、山羊傳染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia，CCPP)是山羊特有的急性或慢性高度接觸性傳染病，該疾病感染不同年齡階段的山羊，常引起胸腔的病變，其臨床特征為高熱、咳嗽、呼吸困難、纖維素性胸膜肺炎、肺肝變和胸腔積液，具有很高的發(fā)病率和死亡率。本試驗(yàn)從重慶渝北、北碚，西藏山南等地區(qū)的病死山羊采集病料，采集部位主要為肺臟、鼻腔拭子、胸腔積液，其次為心血、肝臟、脾臟、腎臟和淋巴結(jié)等；采用改良型Hart

2、leys培養(yǎng)基，普通瓊脂、鮮血瓊脂和LB瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)病原，從68只病死山羊分離到14株病原菌，其中4株支原體，5株山羊奇異變形桿菌，5株大腸桿菌；本試驗(yàn)對(duì)山羊傳染性胸膜肺炎等病原進(jìn)行分離鑒定、克隆測(cè)序、動(dòng)物試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及部分生物學(xué)特性研究，為CCPP的診斷和預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。
　　 1.山羊支原體的分離鑒定
　　 為了研究CCPP病原，采用改良型Hartleys培養(yǎng)基，從病羊肺臟分離病原。對(duì)分離株進(jìn)行糖發(fā)酵、精氨

3、酸水解、尿素分解、四氮唑還原、膜斑形成、固醇需要等生化試驗(yàn)，動(dòng)物試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)；根據(jù)絲狀支原體簇成員共有的16S rDNA特異性片段設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分離到4株病原，編號(hào)分別為BB3、BB7、BB42、YB2；生化試驗(yàn)結(jié)果表明分離株BB7、BB42生化特性與標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G3相同，分離株BB3、YB2生化特性與PG3存在差異；BB7、YB2對(duì)小鼠有致病性，BB3、BB42對(duì)小鼠無致病性；分離株對(duì)頭孢噻呋鈉的MIC值最低，說明分離株對(duì)頭

4、孢噻呋鈉最敏感，其次為泰樂菌素、紅霉素、氟苯尼考等，而對(duì)林可霉素不敏感；分離株和標(biāo)準(zhǔn)株均擴(kuò)增出548 bp片段。結(jié)果表明分離株屬于絲狀支原體簇。
　　 2.山羊奇異變形桿菌的分離鑒定及克隆測(cè)序
　　 為了分離鑒定病原，采用普通瓊脂、鮮血瓊脂和LB瓊脂培養(yǎng)基，從病死山羊肺臟等分離病原菌，對(duì)分離株進(jìn)行游散行為分析、生化鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)；根據(jù)細(xì)菌16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序。分離到5株

5、病原菌；分離株培養(yǎng)2.5 h-3.5 h開始遷徙，遷徙距離主要隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，遷徙速度2.5 h-4.5 h呈增長趨勢(shì)，5 h-5.5 h呈下降趨勢(shì)；在相同的培養(yǎng)時(shí)間下，分離株在0.5％瓊脂的培養(yǎng)基上遷徙距離最遠(yuǎn)，其次為1.0％、1.5％、2.0％瓊脂，說明遷徙距離與瓊脂濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；分離株具有奇異變形桿菌的基本生化特性；分離株均對(duì)小鼠有致病性，LD50為2.5000×107 cfu·mL-1～4.4453×107cfu·m

6、L-1；分離株對(duì)丁胺卡那霉素、頭孢他啶敏感，對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、氟苯尼考等藥物不敏感；分離株擴(kuò)增出1535 bp條帶，與奇異變形桿菌的同源率為99.5％～99.8％。分離株鑒定為奇異變形桿菌。
　　 3.山羊奇異變形桿菌毒力因子zapA基因的克隆及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
　　 為了研究山羊奇異變形桿菌的毒力因子，克隆zapA基因和預(yù)測(cè)推導(dǎo)的蛋白結(jié)構(gòu)。采用PCR方法，對(duì)山羊奇異變形桿菌毒力因子zapA

7、基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆及序列測(cè)定；利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)ZapA蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞抗原表位。結(jié)果表明，zapA基因長為1476 bp，編碼491個(gè)氨基酸，與參考株的核苷酸序列同源性為99.59％，氨基酸同源性為99.59％；ZapA蛋白存在信號(hào)肽，無跨膜區(qū)；B細(xì)胞表位可能位于69-71，78-84，136-139，197-199，353-356，371-373，472-474氨基酸區(qū)域內(nèi)或附近。山羊奇異變形桿菌存在毒力因

8、子zapA基因，ZapA蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)為蛋白的表達(dá)及基因工程疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。
　　 4.山羊奇異變形桿菌PCR-RFLP分析
　　 為了研究山羊奇異變形桿菌的多態(tài)性，對(duì)分離株16S rDNA和zapA基因進(jìn)行RFLP分析。采用PCR方法，分別擴(kuò)增分離株的16S rDNA和zapA基因，膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；選用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ對(duì)16S rDNA基因進(jìn)行RFLP分析，選用內(nèi)切酶Bal1、DraⅠ、

9、VspⅠ對(duì)zapA基因進(jìn)行RFLP分析；EcoRⅠ酶切產(chǎn)生868 bp、667 bp片段，HindⅢ酶切產(chǎn)生1462 bp、73 bp片段，BalⅠ酶切產(chǎn)生633bp、474 bp、369 bp片段，DraⅠ酶切產(chǎn)生796 bp、627 bp、49 bp、4 bp片段，VspⅠ酶切產(chǎn)生864 bp、411 bp、115 bp、86 bp片段，均與電子酶切結(jié)果相符。結(jié)果表明分離株16S rDNA和zapA基因均未產(chǎn)生限制性片段長度多態(tài)性，

10、酶切位點(diǎn)未發(fā)生改變，說明16S rDNA和zapA基因在一定程度上具有很高的保守性。
　　 5.山羊大腸桿菌的分離鑒定及克隆測(cè)序
　　 為了分離鑒定病原，采用普通瓊脂和鮮血瓊脂培養(yǎng)基，從病死山羊肺臟等分離病原，對(duì)分離株進(jìn)行生化鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)；根據(jù)細(xì)菌16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序。分離到5株病原菌，分離株具有大腸桿菌的生化特性；分離株均對(duì)小鼠有致病性，LD50為4.8395×10