應(yīng)用PCR—RFLP技術(shù)鑒別肉制品中的原料肉種類.pdf

1、本研究利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，以市場(chǎng)上常見(jiàn)的牛肉、豬肉、雞肉、羊肉等及其制品為材料，擴(kuò)增出相關(guān)目的基因，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析，以確定生肉和肉制品中原料肉的種類，旨在探索一種操作簡(jiǎn)便、快捷準(zhǔn)確、成本低廉的肉品質(zhì)量檢測(cè)新技術(shù)。具體研究和結(jié)果如下： 1

2、．肉制品中牛源性成分的檢測(cè)：提取出豬、牛、羊、雞、鴨、兔、魚(yú)7種生肉和市售牛肉干、牛肉棗、牛肉火腿腸及高壓牛肉中的DNA。將生牛肉作為陽(yáng)性對(duì)照，四種牛肉制品作為待測(cè)樣品，其余動(dòng)物樣品作為陰性對(duì)照首先進(jìn)行線粒體DNA通用引物(Cytb1/Cytb2)的擴(kuò)增，檢測(cè)PCR的準(zhǔn)確性和模板的提取質(zhì)量。其后對(duì)11種樣品進(jìn)行牛特異性引物擴(kuò)增，結(jié)果引物擴(kuò)增特異性良好，待測(cè)樣品均擴(kuò)增出清晰明亮條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶。最后，對(duì)特異性擴(kuò)增的陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行Mbo

3、Ⅰ的限制性酶切確認(rèn)，避免結(jié)果的假陽(yáng)性，表明無(wú)假陽(yáng)性產(chǎn)物。此法可準(zhǔn)確鑒別制品中的牛源性成分。 2．肉制品中豬源性成分的檢測(cè)：從豬、牛、羊、雞、鴨、兔6種生肉和高壓豬肉、豬肉火腿腸、豬肉棗、豬肉松及牛肉干、牛肉棗、牛肉火腿腸7種制品中提取出DNA。將生豬肉作為陽(yáng)性對(duì)照，四種豬肉制品作為待測(cè)樣品，其余動(dòng)物樣品作為陰性對(duì)照進(jìn)行線粒體DNA通用引物(Cytb1/Cytb2)的擴(kuò)增，樣品均擴(kuò)增出清晰明亮的359bp大小的條帶；然后用Alu

4、Ⅰ對(duì)所有結(jié)果進(jìn)行限制性酶切，其中豬源性成分產(chǎn)生244 bp和115 bp 2個(gè)片段，牛源性成分產(chǎn)生190 bp和169 bp 2個(gè)片段，其余動(dòng)物樣品不產(chǎn)生切割。豬、牛片段的差異可通過(guò)電泳辨別出來(lái)。由此可檢測(cè)出食品中的豬源性成分，同時(shí)此法還可同時(shí)鑒別出肉制品中的豬和牛源性成分。 3．肉制品中羊源性成分的檢測(cè)：提取出豬、牛、羊、雞、鴨、兔、魚(yú)7種生肉和油炸羊肉、水煮羊肉、烤羊肉串及高壓羊肉制品中的DNA。將生羊肉作為陽(yáng)性對(duì)照，四種羊

5、肉熟制品作為待測(cè)樣品，其余動(dòng)物樣品作為陰性對(duì)照首先進(jìn)行線粒體DNA通用引物(Cytb1/Cytb2)的擴(kuò)增，檢測(cè)PCR的準(zhǔn)確性和模板的提取質(zhì)量。其后對(duì)11種樣品進(jìn)行羊特異性PCR擴(kuò)增，結(jié)果引物擴(kuò)增特異性良好，待測(cè)樣品均擴(kuò)增出清晰明亮條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶。最后，對(duì)特異性擴(kuò)增的陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行Sau3A Ⅰ的限制性酶切確認(rèn)，避免結(jié)果的假陽(yáng)性，表明無(wú)假陽(yáng)性產(chǎn)物。此法可準(zhǔn)確鑒別制品中的羊源性成分。 4．肉制品中雞源性成分的檢測(cè)：提取出豬、牛

6、、羊、雞、鴨、兔、魚(yú)7種生肉和紅燒雞翅、烤雞肉、雞肉火腿腸及高壓雞肉中的DNA。將生雞肉作為陽(yáng)性對(duì)照，四種雞肉制品作為待測(cè)樣品，其余動(dòng)物樣品作為陰性對(duì)照首先進(jìn)行線粒體DNA通用引物(Cytb1/Cytb2)的擴(kuò)增，檢測(cè)PCR的準(zhǔn)確性和模板的提取質(zhì)量。其后對(duì)11種樣品進(jìn)行雞特異性PCR擴(kuò)增，結(jié)果引物擴(kuò)增特異性良好，待測(cè)樣品均擴(kuò)增出清晰明亮條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶。最后，對(duì)特異性擴(kuò)增的陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行Hind Ⅲ的限制性酶切確認(rèn)，避免結(jié)果的假陽(yáng)性，