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文檔簡介
1、目的:
建立巢式.多聚酶鏈反應(yīng),限制性片段長度多態(tài)性分析(nested-polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism,nested-PCR-RFLP)方法檢測血清線粒體DNA T16189C(mitochondrial DNA T16189C,mtDNA T16189C)變異,分析T16189C多態(tài)性與重慶地區(qū)非糖尿病性(non-diabet
2、es mellitus,non-DM)重度冠心病(coronary heart disease,CHD)的相關(guān)性。
方法:
1.建立血清DNA的提取方法,設(shè)計針對mtDNA T16189C變異位點的外套引物和內(nèi)套引物,分別以內(nèi)套引物行常規(guī)PCR,以內(nèi)、外套引物行nested-PCR擴增目的基因,電泳確認(rèn)血清mtDNA提取成功,并比較兩種方法對血清mtDNA檢測的敏感性。nested-PCR產(chǎn)物經(jīng)RFLP和測序鑒定確認(rèn)
3、mtDNA T16189C變異位點,并對nested-PCR-RFLP進行方法學(xué)評價。
2.收集中國重慶地區(qū)82例非糖尿病性重度CHD患者血清及對應(yīng)臨床資料,50例非糖尿病、非冠心病受試者血清作為對照。提取血清DNA,聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)PCR及nested-PCR評估不同組別血清mtDNA含量的高低。利用建立的nested-PCR-RFLP方法檢測mtDNA T16189C變異位點,分別比較mtDNA含量、mtDNA T16189C
4、變異與該類人群的相關(guān)性,并進一步分析非糖尿病性重度CHD不同mtDNA含量組間mtDNA T16189C變異情況。
結(jié)果:
1.血清mtDNA的提取和nested-PCR-RFLP方法的建立及評價:(1)成功建立了血清mtDNA提取和血清mtDNA的nested-PCR-RFLP方法,通過實驗優(yōu)化得到PCR和酶切反應(yīng)的最佳條件,經(jīng)RFLP和測序鑒定與預(yù)期結(jié)果一致。(2)nested-PCR電泳檢測Qiagen試劑盒所
5、提200μ人類血清的mtDNA的敏感性為100%,nested-PCR-RFLP檢測血清mtDNA T16189C多態(tài)性簡單快速、特異性和敏感性均高。
2.血清mtDNA濃度及mtDNA T16189C變異與非糖尿病性重度CHD危險因素的相關(guān)性分析:(1)血清mtDNA含量在非糖尿病性重度CHD患病組顯著低于健康對照組(X2=9.979,P<0.05,OR=0.318,95% CI:0.153~0.660);在患病組中,女性高
6、于男性,并隨年齡增加而增加,高LDL-c組低于正常組、吸煙低于非吸煙組(P<0.05);在血壓、HDL-c,TC、血糖調(diào)節(jié)各組內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。多因素非條件logistic回歸分析結(jié)果顯示:吸煙(OR=3.70;95% CI:1.285~10.870)是導(dǎo)致血清mtDNA濃度減低的主要影響因素。(2)mtDNA T16189C變異率在非糖尿病性重度CHD組(32.93%)高于健康對照組(22%),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P
7、>0.05);在重度CHD病人中,合并血糖調(diào)節(jié)受損(impired glucose tolerance,IGT)者明顯高于血糖正常者和健康對照(P<0.05),但血糖正常重度CHD組和健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);在重度CHD病人中,合并高血壓者高于血壓正常重度CHD組和健康對照組(P<0.05),但血壓正常重度CHD組和健康對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。重度CHD組內(nèi)及其與對照組之間,mtDNA T16189
8、C變異率與性別、年齡、吸煙、LDL-c、HDL-c、TC等因素均無關(guān),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。非條件logistic回歸分析結(jié)果顯示:高血壓(OR=3.265;95% CI:1.061~10.06)是導(dǎo)致血清mtDNA T16189C變異的主要影響因素。(3)非糖尿病性重度CHD患者血清mtDNA T16189C變異率在mtDNA高濃度組顯著高于低濃度組(X2=5.612,P<0.05;OR=3.154,95% CI:0.19
9、7~8.307)。
結(jié)論:
成功建立了血清mtDNA T16189C的提取及nested-PCR-RFLP方法,可作為循環(huán)mtDNA基因多態(tài)性和相關(guān)性流行病學(xué)研究的重要工具之一。
非糖尿病性重度CHD患者血清mtDNA含量顯著低于健康對照,且女性組高于男性組、高齡組高于低齡組、高LDL組低于正常組、吸煙低于非吸煙組;并且吸煙足導(dǎo)致血清mtDNA濃度減低的主要影響因素。mtDNA T16189C變異率與血糖調(diào)
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