大鼠足細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

1、大鼠足細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定賈苗，張益民，賴德源（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院腎內(nèi)科，廣州510120）[摘要]目的目的建立一種重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便的大鼠足細(xì)胞培養(yǎng)方法。方法方法取重量200~220g的健康雌性SD大鼠，無(wú)菌取腎后通過(guò)差異過(guò)篩法分別通過(guò)80、150、200目細(xì)胞篩網(wǎng)，收集200目篩網(wǎng)上腎小球進(jìn)行接種，利用植塊法將接種培養(yǎng)面向上放置，4.5h后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)正常放置于37℃、5%C02的恒溫恒濕培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育。采用形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞

2、間接免疫熒光技術(shù)，對(duì)足細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行足細(xì)胞純度分析。結(jié)果結(jié)果5d后可見(jiàn)絕大部分腎小球貼壁并有少許腎小球周圍有細(xì)胞爬出，7~8d可見(jiàn)所有腎小球周圍有大量細(xì)胞爬出，胰酶消化后傳代培養(yǎng)。形態(tài)學(xué)及特異性抗體WT1nephrin鑒定為足細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞純度99%左右。結(jié)論結(jié)論3層篩網(wǎng)法分離大鼠腎小球，結(jié)合植塊法促進(jìn)腎小球貼壁，可以簡(jiǎn)單、高效地培養(yǎng)出原代足細(xì)胞，且具備足細(xì)胞生物學(xué)特性，且在操作簡(jiǎn)單的情況下細(xì)胞產(chǎn)量、純度與國(guó)

3、外文獻(xiàn)報(bào)道的相當(dāng)[關(guān)鍵詞]足細(xì)胞；細(xì)胞原代培養(yǎng)；大鼠[中圖法分類號(hào)]R322.61；R329.24[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]近年來(lái)隨著對(duì)腎小球疾病發(fā)病機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致其持續(xù)進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞[1]，如微小病變腎病、局灶節(jié)段硬化腎病、膜性腎病和糖尿病腎病等。足細(xì)胞因?yàn)楦叨确只?、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、定位特殊，體外培養(yǎng)的方法一直以來(lái)都受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者大量的關(guān)注并不斷的被改善。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和免疫磁珠分離技術(shù)的使用，國(guó)外已有實(shí)驗(yàn)室成功建立了人[2]、鼠【

4、3】的條件永久性足細(xì)胞株，但由于所要求的技術(shù)較高，花費(fèi)較多，增加了普遍應(yīng)用的難度，因此本文旨在建立一種簡(jiǎn)便可行、重復(fù)性好的大鼠腎小球足細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，為研究腎小球疾病的發(fā)病機(jī)制等提供一個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠，雌性，體重200~220g。購(gòu)買自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0051349，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SCXK（粵）20040011。1.2主要儀器與試劑超凈工作臺(tái)，無(wú)菌手術(shù)室，高級(jí)熒光

5、分析倒置顯微鏡，流式細(xì)胞儀，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，80、150、200目不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)。DMEMF12培養(yǎng)液、ITS、青鏈霉素、FBS及胰酶EDTA均購(gòu)自GIBCO（美國(guó)）公司，PBS(吉諾，中國(guó))，兔抗大鼠nephrinWT1多克隆抗體（Abcam美國(guó))，PI（碘化吡啶）和FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德公司。1.3大鼠腎小球足細(xì)胞原代培養(yǎng)1.3.1主要試劑的配制含有5%FBS的完全培養(yǎng)基500mL內(nèi)含有DMEMF12培養(yǎng)液465m

6、L，F(xiàn)BS25mL，ITS5mL，青鏈霉素5mL，于超凈工作臺(tái)內(nèi)配制。1.3.2大鼠腎小球的分離采用差異過(guò)篩法【46】分離腎小球，并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)：①于無(wú)菌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)室內(nèi)脫頸處死大鼠后，固定在手術(shù)臺(tái)上，消毒腹部皮膚后，沿腹部前[基金項(xiàng)目]廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2007B011000009）[通信作者]賴德源，電話：（020）81332487正中線與臍水平線做十字切口，充分暴露腎臟后，用剪刀剪下雙側(cè)腎臟，并迅速放置于裝有預(yù)冷DMEMF12培

7、養(yǎng)液的無(wú)菌離心管中，并放于冰盒內(nèi)。將腎臟移入超凈臺(tái)中，去除腎臟外周脂肪組織，剝除完整腎包膜，用預(yù)冷的含有10%青鏈霉素的PBS液沖洗3次。②從腎門處將腎臟沿縱形長(zhǎng)軸剖為兩半，可見(jiàn)紅色顆粒樣外觀的皮質(zhì)，用手術(shù)刀分離腎皮質(zhì)后將其轉(zhuǎn)移至80目細(xì)胞篩網(wǎng)中，剪碎成1~2mm3大小，用玻璃注射器針芯進(jìn)行研磨至糜狀，邊研磨邊用裝有預(yù)冷的PBS的注射器進(jìn)行沖洗，滴速要慢、輕，至糜狀物顏色發(fā)白似纖維結(jié)締組織，收集濾過(guò)液再通過(guò)150目篩網(wǎng)，用針芯在150目

8、篩網(wǎng)上輕輕研磨并用PBS不斷沖洗，最后將濾過(guò)液通過(guò)200目篩網(wǎng)，收集200目篩網(wǎng)上的腎小球。上述超凈臺(tái)內(nèi)的所有操作均在冰盒上進(jìn)行。1.3.3腎小球的接種和培養(yǎng)將收集的腎小球離心5min1500rpm沉淀物中加入完全培養(yǎng)基2ml(2只大鼠)重懸，接種至3瓶75cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并每瓶加入10ml完全培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)瓶使接種面向上放入37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育4.5h后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)使其正常放置。1.3.4足細(xì)胞消化、傳代：腎

9、小球接種第5天少量的內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)觀察不到，視野中為大量貼壁腎小球及從少數(shù)腎小球周圍爬出的細(xì)胞，此時(shí)首次換液，之后繼續(xù)培養(yǎng)，第78d后，用0.25%胰酶0.02%EDTA進(jìn)行消化，將消化下來(lái)的產(chǎn)物通過(guò)200目篩網(wǎng)以去除腎小球，此時(shí)的腎小球主要包含系膜細(xì)胞，收集過(guò)濾液離心5min1500rpm完全培養(yǎng)基重懸，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按25cm2培養(yǎng)瓶：2.0105瓶，24孔板:3.0104孔的細(xì)胞密度接種，放入37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)

10、孵育。1.4大鼠腎小球足細(xì)胞的鑒定首次傳代后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7d待細(xì)胞鋪滿瓶底后行細(xì)胞免疫熒光染色鑒定，期間每隔一天換液一次。經(jīng)20℃冷丙酮固定10min，PBS洗滌3次，每次5min，0.3%TritonX100破膜3~5minPBS洗滌3次，每次5min，5%BSA室溫封閉30min。加一抗（5%BSA稀釋1:1000)兔抗大鼠nephrinWT1多克隆抗體后4℃冰箱孵育過(guò)夜，陰性對(duì)照組僅加抗體稀釋液。第2天取出后PBS洗滌3次，每次

11、5min，然后加入FITC標(biāo)記的熒光二抗（5%BSA稀釋1:30)37℃溫箱中心的呈多邊形鋪路石樣的細(xì)胞，另一種位于集落的最邊上，呈大的不規(guī)則形。多數(shù)學(xué)者普遍認(rèn)為從無(wú)囊腎小球中爬出的細(xì)胞與體內(nèi)足細(xì)胞的表型相同為足細(xì)胞來(lái)源，大的不規(guī)則細(xì)胞為壁層上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，而多邊形細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題一直存在著爭(zhēng)議。部分學(xué)者認(rèn)為它們來(lái)源于腎小球壁層，為壁層上皮細(xì)胞，因?yàn)椋孩倌I小球分離培養(yǎng)時(shí)不可能完全去除鮑曼囊，②表型不同于體內(nèi)的足細(xì)胞而與壁層上皮細(xì)胞相似。

12、具有里程碑性意義的是1997年，Mundel[3]等通過(guò)連續(xù)性觀察原代培養(yǎng)的人和大鼠的足細(xì)胞發(fā)現(xiàn):①培養(yǎng)最初生長(zhǎng)的多邊形細(xì)胞可以原位轉(zhuǎn)變成樹(shù)枝狀細(xì)胞，前者增生能力強(qiáng)，而后者無(wú)增生能力，胞體較大，呈樹(shù)狀分支，常見(jiàn)雙核。②從多邊形細(xì)胞向樹(shù)枝狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過(guò)程中伴隨著細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重組。③兩種細(xì)胞均表達(dá)了足細(xì)胞特征性分子O乙酰神經(jīng)節(jié)苷酯和WT1。Mundel等的這些研究結(jié)果證實(shí)多邊形細(xì)胞和樹(shù)狀細(xì)胞均來(lái)源于足細(xì)胞，兩者代表了處于不同分化狀態(tài)的足細(xì)

13、胞，當(dāng)足細(xì)胞從腎小球長(zhǎng)出時(shí)丟失了其分化的表型，并且在長(zhǎng)期的培養(yǎng)中又重新獲得，樹(shù)狀細(xì)胞更接近于體內(nèi)分化成熟的足細(xì)胞?；诖耍S著轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展，Mundel[15，16]等人通過(guò)分離轉(zhuǎn)染了溫度敏感的SV40TAg的小鼠腎小球建立了條件永久性的足細(xì)胞株，也是目前國(guó)內(nèi)外使用最多的足細(xì)胞來(lái)源。但此種方法所需要的轉(zhuǎn)基因小鼠價(jià)格昂貴，來(lái)源困難，Shankl[17]報(bào)道這種細(xì)胞株很難有效的進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染進(jìn)去的基因在改變生長(zhǎng)環(huán)境時(shí)發(fā)生丟失，限制其推廣應(yīng)

14、用。因此，研究原代培養(yǎng)的方法和技巧也顯得尤為重要和必要。我們?cè)隗w外培養(yǎng)的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了上述3種表型的細(xì)胞，按照Mundel的觀點(diǎn)，我們將3種細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行消化傳代，發(fā)現(xiàn)有囊腎小球細(xì)胞群最外圍的細(xì)胞很難消化下來(lái)，因此消化下來(lái)的細(xì)胞類型為兩種，待細(xì)胞生長(zhǎng)成熟后行流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞純度可達(dá)95%以上。另外，由于足細(xì)胞的復(fù)雜生物學(xué)特征，因此在培養(yǎng)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)以下問(wèn)題值得特別關(guān)注：①第1次用完全培養(yǎng)基重懸腎小球時(shí)所加的液體量不能過(guò)多，一般以剛

15、好鋪滿培養(yǎng)瓶底面為宜，向培養(yǎng)瓶里加入培養(yǎng)基時(shí)注意方向，不能將接種的腎小球沖下來(lái)。因?yàn)橹矇K法本身即是讓組織在貼壁前不要接觸培養(yǎng)基，以免受液體的漂浮作用而難以貼壁。②接種4.5h后翻轉(zhuǎn)是我們根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中心的條件摸索出來(lái)最適于腎小球貼壁的時(shí)間段，我們分別觀察了2.5、3、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0h，發(fā)現(xiàn)4.5h的腎小球貼壁率最高。③文獻(xiàn)[18]報(bào)道系膜細(xì)胞從腎小球爬出的時(shí)間約為第7天。我們選擇腎小球接種7天后進(jìn)行消化傳代，將含有

16、系膜細(xì)胞的腎小球過(guò)濾掉，將足細(xì)胞進(jìn)行傳代。我們?cè)^察發(fā)現(xiàn)，在第7天時(shí)如果不傳代，而繼續(xù)換液后培養(yǎng)，從腎小球中逐漸爬出長(zhǎng)梭形的細(xì)胞，為系膜細(xì)胞，形態(tài)明顯不同于足細(xì)胞。參考文獻(xiàn)：[1]ShanklSJ:Thepodocyte’sresponsetoinjury:roleinproteinuriaglomerulosclerosis［J］.KidneyInt2006，69:21312147.[2]SaleemMAO’HareMJReiserJ

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