奶牛乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、內(nèi)蒙’i人學(xué)頌上學(xué)位淪文學(xué)校代碼分類號UDC10126學(xué)號墨!呈Q璺!Q曼密級編號——論文題目研究生：塑整圖指導(dǎo)教師：王圭銦塾拯專業(yè)：生物工程研究方向：丞筮些生物工程所在學(xué)院：生金抖堂堂院2015年4月27日內(nèi)蒙；oi人學(xué)碩上學(xué)僦論文奶牛乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定摘要為了體外分離培養(yǎng)純度較高的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，本研究用組織塊貼肇法和乳汁分離法分離培養(yǎng)了原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，并用胰酶梯度消化法純化了

2、上述細(xì)胞，接著對原代乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的特異性分子角蛋白8、角蛋白18和D一酪蛋白進(jìn)行RT—PCR鑒定、角蛋白7、角蛋白18和p一酪蛋白進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色鑒定，還對它們進(jìn)行細(xì)胞染色體組型分析、Giemsa染色觀察、營養(yǎng)要求分析和生長曲線測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，組織塊貼壁法得到了純度分別為963％和997％乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，乳汁分離法得到了純度為989％的乳腺上皮細(xì)胞。進(jìn)一步的鑒定表明，組織塊貼壁法和乳汁分離法得到的乳腺上皮細(xì)

3、胞均轉(zhuǎn)錄角蛋白8基因、角蛋白18基因和B一酪蛋白基因mRNA；表達(dá)角蛋白7、角蛋白18和D一酪蛋白；細(xì)胞染色體核型典型(2n=60)，具有正常的分裂增殖特征：組織塊貼壁法得到的乳腺上皮細(xì)胞原代細(xì)胞活力高于8Lft分離法：細(xì)胞培養(yǎng)需要在DMEM／F12培養(yǎng)液中添加20％FBS、200U雙抗(青霉素和鏈霉素)、氫化考的松(1lag／m1)、孕酮(199／m1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(599／m1)、胰島素(5Ixg／m1)、200mmolL一谷氨酰胺和

4、10ng／mlEGF。組織塊分離培養(yǎng)得到的奶牛乳腺成纖維細(xì)胞可以表達(dá)波形蛋白，不表達(dá)13酪蛋白，細(xì)胞染色體核型正常(2n=60)，形態(tài)典型；細(xì)胞可以在基本培養(yǎng)基DMEM／F12(含10％的FBS)上生長旺盛以及具有正常的分裂增殖特征，生長活力明顯高于奶牛乳腺上皮細(xì)胞。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過組織塊貼壁法和乳汁分離法，成功分離到了形態(tài)特征典型、純度較高、分裂增殖能力正常的奶牛乳腺成纖維細(xì)胞和能分泌B一酪蛋白的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，為后續(xù)建立泌乳、