奶牛乳腺上皮細胞和成纖維細胞原代培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、內(nèi)蒙’i人學頌上學位淪文學校代碼分類號UDC10126學號墨!呈Q璺!Q曼密級編號——論文題目研究生：塑整圖指導教師：王圭銦塾拯專業(yè)：生物工程研究方向：丞筮些生物工程所在學院：生金抖堂堂院2015年4月27日內(nèi)蒙；oi人學碩上學僦論文奶牛乳腺上皮細胞和成纖維細胞原代培養(yǎng)與鑒定摘要為了體外分離培養(yǎng)純度較高的原代奶牛乳腺上皮細胞和成纖維細胞，本研究用組織塊貼肇法和乳汁分離法分離培養(yǎng)了原代奶牛乳腺上皮細胞和成纖維細胞，并用胰酶梯度消化法純化了

2、上述細胞，接著對原代乳腺上皮細胞和成纖維細胞的特異性分子角蛋白8、角蛋白18和D一酪蛋白進行RT—PCR鑒定、角蛋白7、角蛋白18和p一酪蛋白進行細胞免疫熒光染色鑒定，還對它們進行細胞染色體組型分析、Giemsa染色觀察、營養(yǎng)要求分析和生長曲線測定。實驗結果表明，組織塊貼壁法得到了純度分別為963％和997％乳腺上皮細胞和成纖維細胞，乳汁分離法得到了純度為989％的乳腺上皮細胞。進一步的鑒定表明，組織塊貼壁法和乳汁分離法得到的乳腺上皮細

3、胞均轉(zhuǎn)錄角蛋白8基因、角蛋白18基因和B一酪蛋白基因mRNA；表達角蛋白7、角蛋白18和D一酪蛋白；細胞染色體核型典型(2n=60)，具有正常的分裂增殖特征：組織塊貼壁法得到的乳腺上皮細胞原代細胞活力高于8Lft分離法：細胞培養(yǎng)需要在DMEM／F12培養(yǎng)液中添加20％FBS、200U雙抗(青霉素和鏈霉素)、氫化考的松(1lag／m1)、孕酮(199／m1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(599／m1)、胰島素(5Ixg／m1)、200mmolL一谷氨酰胺和

4、10ng／mlEGF。組織塊分離培養(yǎng)得到的奶牛乳腺成纖維細胞可以表達波形蛋白，不表達13酪蛋白，細胞染色體核型正常(2n=60)，形態(tài)典型；細胞可以在基本培養(yǎng)基DMEM／F12(含10％的FBS)上生長旺盛以及具有正常的分裂增殖特征，生長活力明顯高于奶牛乳腺上皮細胞。綜上所述，本實驗通過組織塊貼壁法和乳汁分離法，成功分離到了形態(tài)特征典型、純度較高、分裂增殖能力正常的奶牛乳腺成纖維細胞和能分泌B一酪蛋白的奶牛乳腺上皮細胞，為后續(xù)建立泌乳、