熒光探針的光譜性質(zhì)

1、緒論1.1前言Aβ140是阿爾茨海默病的主要標(biāo)志物之一，且Aβ單體可以自組裝成高度有序的結(jié)構(gòu)，包括二聚體、三聚體、四聚體，或者更大的結(jié)構(gòu)，直至形成纖維。研究表明，Aβ寡聚體具有更強(qiáng)的神經(jīng)毒性，二聚體和三聚體會(huì)破壞神經(jīng)纖維的彈性，而三聚體和四聚體的毒性是Aβ纖維的二倍?？傊芯勘砻鰽β早期積聚體可能是疾病診斷的依據(jù)之一[16]。因此能夠及時(shí)、簡(jiǎn)便、有效的檢測(cè)出Aβ的這種異常的現(xiàn)象，則對(duì)于預(yù)防和治療AD既有重要的理論意義又有實(shí)際意義。為了

2、檢測(cè)Aβ的寡聚體，已經(jīng)發(fā)展了抗體和單鏈抗體技術(shù)[78]，已報(bào)道這些抗體和特征分子形成特異性識(shí)別作用[9]。熒光分析法靈敏度高，使用方法簡(jiǎn)便，而且樣品處理簡(jiǎn)單，具有在溶液中可無損、實(shí)時(shí)連續(xù)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因此得到廣泛應(yīng)用[1621]。本文基于Aβ抗體的研究基礎(chǔ)，結(jié)合熒光技術(shù)，以Aβ的DNA適配體為識(shí)別基團(tuán)，結(jié)合熒光分析方法特點(diǎn)，制備熒光探針，識(shí)別Aβ早期積聚體。而探針TSO508序列(5to3)為GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGC

3、G。本文針對(duì)探針TSO508對(duì)Aβ作用及檢測(cè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。我們的實(shí)驗(yàn)證明，所制備的熒光探針對(duì)Aβ140具有一定的識(shí)別作用，但是由于用于檢測(cè)的Aβ140沒有以分子量將其區(qū)分，所以識(shí)別作用不是特別穩(wěn)定，下一步準(zhǔn)備看能否將Aβ140分開，特征檢測(cè)二聚體和三聚體。2實(shí)驗(yàn)部分2.1試劑和藥品TSO508（生物工程上海股份有限公司，1mg，AR）修飾5JOE3TAMRA，JOE：2，7二甲基4，5二氯6羧基熒光素，是熒光素衍生物的一種，6JOE更被廣泛

4、使用。JOE熒光保持所用儀器的清潔。每次加入試劑之前要用擦鏡紙擦拭移液槍、微量進(jìn)樣器等，并多次更換移液頭。②第2組為Aβ純度為95.65%加入0.5mL二甲基亞砜配置成濃度為462μM的Aβ作為工作液2，TSO508探針仍使用第1組中配置好的濃度。儀器及實(shí)際操作同上，但唯一不同的是本次實(shí)驗(yàn)要控制溫度為37，打開白色暗箱使其停留在stby狀態(tài)，同時(shí)打開恒溫水浴鍋，此時(shí)要注意檢查循環(huán)水是否正常流通，待溫度達(dá)到37℃時(shí)才可以開始掃描。（水浴鍋

5、上顯示的溫度不準(zhǔn)，以界面上溫度控制系統(tǒng)顯示的溫度為準(zhǔn)），每次加入試劑后待溫度穩(wěn)定后再掃描。③第3組為Aβ純度為98%，加入0.5mL二甲基亞砜配置成濃度為462μM的Aβ作為工作液2；TSO508仍用第1組配置好的濃度；儀器與試劑操作同第一組。此次實(shí)驗(yàn)同樣控制溫度，但不用恒溫水浴鍋，采用試管加熱器。首先將試管加熱器設(shè)置為37℃，之后在每次加入工作液后將比色皿放入試管加熱器中大約加熱5min即可達(dá)到37℃，取出并快速放入熒光檢測(cè)儀中進(jìn)行掃

6、描。（2）熒光探針的測(cè)定熒光光譜的測(cè)定，取2.0mlTE緩沖溶液置于已洗滌干凈并用其溶液潤(rùn)洗過的比色皿中，作為參比，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)526nm，中速掃描，響應(yīng)時(shí)間為自動(dòng)，測(cè)定范圍為527650nm，掃描出發(fā)射線；再設(shè)定發(fā)射波長(zhǎng)為553nm，中速掃描，響應(yīng)時(shí)間為自動(dòng)，測(cè)量范圍為450550nm，掃描出激發(fā)線，熒光激發(fā)狹縫寬度為10nm，發(fā)射狹縫寬度為5nm。再向比色皿中加入5μL工作液1，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)526nm，中速掃描，響應(yīng)時(shí)間為自動(dòng)，測(cè)定