分子標(biāo)記技術(shù)

1、分子標(biāo)記技術(shù)分子標(biāo)記技術(shù)摘要：摘要：分子標(biāo)記技術(shù)就是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)基礎(chǔ)分析DNA分子特性，并借助一些統(tǒng)計(jì)工具，將不同物種或同一物種的不同類群區(qū)分開(kāi)來(lái)，或者將生物體的某些性狀與DNA分子特性建立起來(lái)的關(guān)聯(lián)關(guān)系，已廣泛應(yīng)用于植物遺傳與育種研究的眾多領(lǐng)域，包括遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析、物種起源與進(jìn)化、品種資源與純度鑒定、分子輔助育種等多個(gè)方面，具有重大作用。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：分子標(biāo)記技術(shù)原理RFLPRAPDSSRAFLPESTSNPT

2、RAP分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用引言引言分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種遺傳標(biāo)記——形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記具有的優(yōu)越性有：大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，對(duì)隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無(wú)限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；分子標(biāo)記揭示來(lái)自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，

3、與不良性狀無(wú)連鎖；檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、迅速。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆等方面。一常用分子標(biāo)記原理一常用分子標(biāo)記原理分子標(biāo)記技術(shù)的種類根據(jù)不同的核心技術(shù)基礎(chǔ)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)大致可分為三類:第一類以Southern雜交為核心其代表性技術(shù)為RFLP；第二類以PCR技術(shù)為核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第

4、三類以DNA序列(mRNA或單核苷酸多態(tài)性)為核心，其代表性技術(shù)為EST標(biāo)記、SNP標(biāo)記等。理想的分子標(biāo)記應(yīng)達(dá)到以下的要求：①具有高的多態(tài)性；②共顯性遺傳；③能夠明確辨別等位基因；④分布于整個(gè)基因組中；⑤選擇中性(即無(wú)基因多效性)；⑥檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、快速；⑦開(kāi)發(fā)成本和使用成本盡量低廉；⑧在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性好。目前，沒(méi)有任何一種分子標(biāo)記均滿足以上的要求，它們均具有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足。其特點(diǎn)比較見(jiàn)表一。1限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（

5、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（RestrictionRestrictionFragmentFragmentLengthLengthPolymphismPolymphism，RFLPRFLP）1974年，Grozdicker等人鑒定溫度敏感表型的腺病毒DNA突變體時(shí)，發(fā)現(xiàn)了經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶解后得到的DNA片段產(chǎn)生了差異，由此首創(chuàng)了第一代DNA分子標(biāo)記技術(shù)——限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(RFLP)。其原理是由于不同個(gè)體基因型中內(nèi)切酶位

6、點(diǎn)序列不同(可能由堿基插入、缺失、重組或突變等造成)，利用限制性內(nèi)切酶酶解基因組DNA時(shí)，會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的DNA酶切片Repeat，STR)。真核生物基因組中存在大量重復(fù)頻率極高而順序復(fù)雜性極低的串聯(lián)重復(fù)序列[5]。按重復(fù)基序的長(zhǎng)度可將串聯(lián)重復(fù)序列分為衛(wèi)星DNA（基序100300bp）、小衛(wèi)星DNA（基序1060bp）、微衛(wèi)星DNA（基序16bp）。和中衛(wèi)星DNA（由不同大小串聯(lián)重復(fù)組成）等。微衛(wèi)星是由DNA復(fù)制或修復(fù)過(guò)程中DNA滑動(dòng)和

7、錯(cuò)配或者有絲分裂、減數(shù)分裂期姐妹染色單體不均等交換引起的。微衛(wèi)星的突變率在不同物種、同一物種的不同位點(diǎn)或同一位點(diǎn)的不同等位基因間存在很大差異。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，根據(jù)這兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過(guò)PCR技術(shù)將期間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來(lái)，利用電泳分析技術(shù)就可以得到其長(zhǎng)度的多態(tài)性，此即SSR標(biāo)記的原理。SSR標(biāo)記具有高度重復(fù)性、豐富的多態(tài)性、共顯性、高度可靠性等優(yōu)點(diǎn)，但由

8、于其需要對(duì)所研究物種的一系列微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行克隆和測(cè)序分析，以便設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，這是非常費(fèi)時(shí)、費(fèi)力和代價(jià)昂貴的工作，沒(méi)有足夠的投資、人力和時(shí)間，是不可能實(shí)現(xiàn)的，因而給它的利用帶來(lái)了一定困難。簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)標(biāo)記(InterSimpleSequenceRepeat，ISSR)可以克服以上提到的SSR標(biāo)記的缺點(diǎn)，或稱錨定簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(AnchedSimpleSequenceRepeat，ASSR)。在SSR序列的3’端或5’端加上一個(gè)24

9、bp的隨機(jī)核苷酸，形成微衛(wèi)星DNA的錨定引物，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。所擴(kuò)增的interSSR區(qū)域的多個(gè)條帶通過(guò)電泳可分辨，呈現(xiàn)出擴(kuò)增帶的多態(tài)性。該方法不需知道DNA序列即可用錨定引物擴(kuò)增。4擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(Amplified(AmplifiedFragmentFragmentLengthLengthPolymphismPol

10、ymphism，AFLP)AFLP)1993年，荷蘭科學(xué)家Zbaeau和Vos發(fā)現(xiàn)了一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的新方法，即擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(AFLP)。AFLP是RFLP與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，其原理是先用兩種限制性內(nèi)切酶(低頻剪切酶和高頻剪切酶，前者識(shí)別為點(diǎn)為6bp，后者為4bp)雙酶切基因組DNA產(chǎn)生不同大小的DNA片段，酶切產(chǎn)物玉雙鏈人工接頭連接，作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板DNA，然后以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，最后在接頭互補(bǔ)鏈的基

11、礎(chǔ)上添加13bp選擇性核苷酸作引物對(duì)模板DNA再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，電泳分離獲得的DNA擴(kuò)增片段，根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同檢測(cè)出多態(tài)性。引物由三部分組成：與人工接頭互補(bǔ)的核心堿基序列、限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列、引物3’端的選擇堿基序列(110bp)。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個(gè)堿基序列為結(jié)合位點(diǎn)。該技術(shù)的獨(dú)特之處在于所用的專用引物在不知道DNA信息的前提下就可對(duì)酶切片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，具有分辨

12、率高、穩(wěn)定性好、效率高的優(yōu)點(diǎn)。但它的技術(shù)費(fèi)用昂貴，對(duì)DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高。盡管AFLP技術(shù)誕生時(shí)間較短，但可稱之為分子標(biāo)記技術(shù)的又一次重大突破，被認(rèn)為是目前一種十分理想、有效的分子標(biāo)記。5表達(dá)序列標(biāo)簽標(biāo)記（表達(dá)序列標(biāo)簽標(biāo)記（ExpressedExpressedSequenceSequenceTagTag，ESTEST）1991年，Adams等人用EST對(duì)表達(dá)序列進(jìn)行了研究，他們從人腦cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取600個(gè)克隆，測(cè)序