分子標(biāo)記技術(shù)在日本對(duì)蝦育種中的應(yīng)用研究.pdf

1、日本對(duì)蝦是我國(guó)重要的對(duì)蝦養(yǎng)殖種類，開展其良種選育工作具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。本文以日本對(duì)蝦育種群體為材料，用微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)不同選育群體進(jìn)行遺傳鑒定，并建立了基于微衛(wèi)星信息的遺傳參數(shù)估計(jì)方法，為進(jìn)一步開展日本對(duì)蝦分子輔助選育工作奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。對(duì)日本對(duì)蝦育種群體進(jìn)行耐高溫測(cè)試，分析高溫耐受性與生長(zhǎng)性狀、近交水平的關(guān)系；利用SLAF測(cè)序法篩選與耐高溫性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，為改良日本對(duì)蝦高溫耐受性提供分子輔助手段。
　　利用8對(duì)微衛(wèi)

2、星引物對(duì)日本對(duì)蝦養(yǎng)殖群體兩個(gè)世代的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，共計(jì)檢測(cè)到108個(gè)等位基因，等位基因長(zhǎng)度為196-528bp，各位點(diǎn)等位基因數(shù)為6-23個(gè)。親本和子代群體每個(gè)位點(diǎn)平均等位基因數(shù)目分別為8.5個(gè)和11.5個(gè)，平均觀測(cè)雜合度分別為0.7211和0.6319，平均期望雜合度分別為0.7748和0.7635，平均多態(tài)信息含量分別為0.7315和0.7286。根據(jù)標(biāo)記信息利用最大似然法對(duì)兩個(gè)世代的個(gè)體分別進(jìn)行系譜結(jié)構(gòu)推斷，親本群體劃分為6個(gè)

3、群體，群體間遺傳距離為0.2773-2.356，均值為1.5097；子代群體劃分為17個(gè)群體，群體間遺傳距離為0-2.5929，均值為1.1132。親本和子代分群體間的遺傳距離變化范圍為0-3.0892，均值為1.2380。根據(jù)各分群體間的Nei’s遺傳距離，用非加權(quán)組平均法（UPGMA）構(gòu)建了日本對(duì)蝦兩個(gè)世代的遺傳進(jìn)化樹。其中18個(gè)分群體（4個(gè)親本群體和14個(gè)子群體）經(jīng)過聚類后形成3個(gè)分支，其余5個(gè)分群體（2個(gè)親本群體和3個(gè)子群體）明

4、顯偏離于主支。研究發(fā)現(xiàn)，子代的觀測(cè)雜合度明顯低于親本，說明子代在繼承親本遺傳信息的過程中已經(jīng)丟失了一定的雜合性。
　　隨機(jī)選取286只人工養(yǎng)殖的日本對(duì)蝦進(jìn)行耐高溫性狀的測(cè)試，對(duì)其8項(xiàng)形態(tài)性狀進(jìn)行測(cè)量。采用相關(guān)分析和通徑分析方法，計(jì)算以日本對(duì)蝦生長(zhǎng)性狀為自變量對(duì)耐高溫性狀做依變量的相關(guān)系數(shù)、通徑系數(shù)、決定系數(shù)以及相關(guān)指數(shù)，定量分析生長(zhǎng)性狀對(duì)耐高溫性狀的影響效果。從耐溫測(cè)試的群體中隨機(jī)選取150個(gè)個(gè)體，用8對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)每個(gè)個(gè)體進(jìn)行基

5、因分型，根據(jù)分型結(jié)果計(jì)算出其近交系數(shù)，分析了近交系數(shù)與生長(zhǎng)性狀和耐高溫性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明，日本對(duì)蝦的8個(gè)形態(tài)性狀與UTT(Upper temperature tolerance)的相關(guān)系數(shù)達(dá)到極顯著水平（p<0.01）。在通徑分析的結(jié)果中保留了達(dá)到顯著水平的體長(zhǎng)、頭胸甲寬、六腹節(jié)長(zhǎng)、二三腹節(jié)寬和二三腹節(jié)高5個(gè)變量，建立了這5個(gè)性狀與UTT的多元回歸方程。在抽取的150個(gè)個(gè)體中的絕大多數(shù)存在不同程度的近交，該群體的近交系數(shù)與體重、體長(zhǎng)

6、和UTT的相關(guān)性均為不顯著。
　　在健壯的日本對(duì)蝦備選親本中挑選15尾雄蝦和30尾雌蝦構(gòu)成交配組，由其自然交尾。最終收獲了12尾雄蝦和20尾受精雌蝦，成功構(gòu)建了6個(gè)日本對(duì)蝦養(yǎng)殖家系。用親本的肌肉組織和多個(gè)早期仔蝦的混合樣提取基因組 DNA，用12對(duì)微衛(wèi)星引物實(shí)現(xiàn)對(duì)親本個(gè)體水平和子代家系水平的基因分型，由分型結(jié)果根據(jù)孟德爾遺傳定律進(jìn)行父本鑒定。最終為6個(gè)家系中的5個(gè)找到了父本，并且發(fā)現(xiàn)有2個(gè)家系的父本為同一尾雄蝦，有1個(gè)家系的父本丟

7、失。本研究驗(yàn)證了在日本對(duì)蝦育種工作中家系生長(zhǎng)早期鑒定出家系父本的可行性。
　　為了給日本對(duì)蝦后續(xù)育種提供參考,用12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)研究了分屬于14個(gè)家系的15個(gè)日本對(duì)蝦養(yǎng)殖群體的親緣關(guān)系。在有效的數(shù)據(jù)中共檢測(cè)到241個(gè)等位基因，各個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目為5-30個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為20.08個(gè)；平均觀測(cè)雜合度范圍為0.804，平均期望雜合度范圍為0.899，平均多態(tài)信息含量范圍為0.889。15個(gè)群體的平均總近交系數(shù)FIT為

8、0.1081，平均家系內(nèi)近交系數(shù)FIS為-0.2338。各位點(diǎn)的平均遺傳分化指數(shù)FST為0.2771，平均基因流指數(shù)Nm為0.6521。根據(jù)群體間的Nei’s遺傳距離用 UPGMA法對(duì)15個(gè)群體進(jìn)行聚類,除屬于一個(gè)家系的群體C6和D12外，B4和C7群體的遺傳關(guān)系最近，C10群體與其他群體的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)。對(duì)個(gè)體的家系重建把每一個(gè)個(gè)體準(zhǔn)確劃入各自分屬的家系。在12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中的8個(gè)檢測(cè)到了無效等位基因。結(jié)果表明研究群體的遺傳多樣性較高，

9、群體間整體遺傳分化較高，基因交流程度低，下一步的配種計(jì)劃中應(yīng)盡量避免B4和C7等親緣關(guān)系近的群體之間的交配以減少近交的發(fā)生。這12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的組合可用作親緣關(guān)系的分析，對(duì)無效等位基因出現(xiàn)頻率較高的位點(diǎn)如76號(hào)位點(diǎn)在以后的研究中應(yīng)慎重選擇。比較了分別用系譜和分子相關(guān)的方法估算日本對(duì)蝦G2代10月齡體重的遺傳參數(shù)，為相關(guān)的科研工作提供參考。
　　采取基于下一代測(cè)序技術(shù)雙末端測(cè)序法的SLAF測(cè)序技術(shù)對(duì)日本對(duì)蝦不耐高溫和耐高溫兩個(gè)性狀池

10、進(jìn)行SNP分子標(biāo)記的篩選，初步探究日本對(duì)蝦與耐高溫性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)的篩查。共獲得總測(cè)序長(zhǎng)度4537440bp，得到了50416個(gè)高質(zhì)量的SLAF標(biāo)記，標(biāo)記的平均測(cè)序深度達(dá)64.48x。含有潛在SNP的SLAF標(biāo)記有4697，占總數(shù)的9.13％，未發(fā)現(xiàn)含有插入或缺失標(biāo)記類型的SLAF。在含有潛在SNP的SLAF標(biāo)記中，共有1,151個(gè)在其中一個(gè)性狀池占主導(dǎo)基因型的標(biāo)記。把主導(dǎo)基因型與非主導(dǎo)基因型的比值大于5的SLAF標(biāo)記認(rèn)為是可能與日