探針標(biāo)記

1、核酸探針已被廣泛用于篩選重組克隆、基因多樣性的種性檢測和真菌種群內(nèi)及種群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系評價。最早使用的放射性同位素標(biāo)記核酸探針具有敏感性高、特異性好、分辨力強的特點，但放射性同位素標(biāo)記也存在著一系列令人困擾的問題如成本高、探針半衰期短、放射性物質(zhì)危害人體健康等。而且在進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記實驗時需要有專門的實驗室及相應(yīng)的實驗保護(hù)設(shè)施，還需要由經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員來操作因而限制了在普通實驗室進(jìn)行分子生物學(xué)實驗。近幾年發(fā)展起來的非放射性核酸

2、探針大多通過酶促、光化學(xué)和化學(xué)手段摻入一種報道基團(tuán)這種報道基團(tuán)可通過高靈敏度的冷光、熒光或金屬沉淀等檢測系統(tǒng)檢測。另外應(yīng)用pH電極或感應(yīng)器技術(shù)的電化學(xué)檢測系統(tǒng)也有報道。在這些檢測系統(tǒng)中靈敏度最高的是生物素親合素檢測系統(tǒng)和半抗原抗半抗原地高辛檢測系統(tǒng)。由于生物樣品中常含有內(nèi)源性生物素及生物結(jié)合蛋白，生物素標(biāo)記的核酸探針會發(fā)生一些非特異性結(jié)合，從而影響實驗效果。與生物素親合素系統(tǒng)同樣具有高靈敏度，卻減少了非特異性結(jié)合的地高辛檢測系統(tǒng)，已為人

3、們所接受并得到廣泛的應(yīng)用。地高辛(DigoxigeninDIG)又稱異羥基洋地黃毒甙元，是一種類固醇半抗原分子。第四節(jié)非放射性標(biāo)記的核酸探針方法稱為缺口平移法。用標(biāo)記在DNA上的生物素與鏈霉親合素酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）標(biāo)記物進(jìn)行檢測。缺口平移法標(biāo)記生物素DNA探針：在硅化Eppendf管（放入冰浴中）加下列反應(yīng)液：待標(biāo)記DNA0.1μgμl5μl10NTB1μlDNaseI2pgμl1μl消毒三蒸水3μl總體積達(dá)10μl混勻，37