細胞凋亡和細胞壞死

1、細胞凋亡與細胞壞死,細胞凋亡（科普詩）,似秋葉的凋零，告別生命之輝煌；那難以計數(shù)的攻擊、誘導，輕啟著道道程序，逼細胞步步走向生命的末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點一點擰淡;,細胞凋亡（科普詩）,似秋葉的凋零，告別生命之輝煌；那難以計數(shù)的攻擊、誘導，輕啟著道道程序，逼細胞步步走向生命的末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點一點擰淡;,危難中的細胞啊，你沉穩(wěn)

2、不亂，DNA片片切割，化云梯直通天堂；細胞體分團相聚，把生命的凝重濃集在小體上；分別了朝夕相處的伙伴，再見了快樂美好的時光；這一切的一切又融入臨近的胞體，騰出的空間再寫生命的篇章。,細胞死亡形式,1. 細胞壞死 由于比較強烈的有害刺激或細胞內環(huán)境的嚴重紊亂而導致的細胞死亡。2. 細胞凋亡 由體內外因素觸發(fā)細胞內預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程稱為細胞凋亡（apoptosis),又稱程序性細胞死亡（programm

3、ed cell death,PCD)。,細胞凋亡與壞死的比較,細胞凋亡的生理和病理意義,1.確保正常發(fā)育、生長:指趾間隙形成；2.維持內環(huán)境穩(wěn)定:組織細胞更新(上皮組織/血細胞/衰老細胞)、生理器官內分泌調控（子宮產后復員/月經期子宮內膜脫落）、受損不能修復細胞或突變細胞清除；3.發(fā)揮積極的防御功能：病原微生物的宿主細胞發(fā)生主動凋亡。,細胞凋亡與疾病發(fā)生機制的新認識,1.該“死”的細胞（如腫瘤細胞、自身反應性免疫細胞）未死，是造成腫

4、瘤、自身免疫性疾病的主要發(fā)病機制之一?！毎蛲霾蛔?.不該“死”的細胞（如神經元、心肌細胞）死了，這與老年性癡呆、心肌缺血/再灌注損傷等發(fā)病有關?！毎蛲鲞^度,細胞凋亡的過程,1.凋亡信號轉導2.凋亡基因激活3.細胞凋亡的執(zhí)行4.凋亡細胞的清除,凋亡過程及分期誘導期 執(zhí)行期 消亡期,凋亡誘導因素,,受體,

5、,cAMPCa2+神經酰胺,,死亡信號,凋亡相關基因激活,,,Dnase激活Capases激活,,巨噬細胞吞噬細胞凋亡細胞,凋亡時細胞的主要變化,一、細胞凋亡的形態(tài)學改變1.細胞膜的變化：微絨毛、細胞突起和細胞表面皺褶消失；胞膜空泡化，內質網(wǎng)不斷擴張并與胞膜融合形成芽狀突起（出芽）；2.細胞質變化：胞質濃縮、細胞器變化（線粒體變大脊增多可空泡化，內質網(wǎng)腔擴大提供包裹膜）；3.細胞核變化：核內

6、染色質濃縮邊集空泡化、固縮、出芽、邊集、凋亡小體（apoposis boby）,,最早期形態(tài)學改變是細胞間的間接丟失 與鄰近細胞脫離并失去微絨毛 胞漿濃縮及核質密度增高 （DNA斷裂） 凋亡小體 識別、吞噬（無炎癥反應）,,,,,,,典型的凋亡小體（apoposis boby）：由透亮空泡和不透光的濃密的核碎片兩部分組成。,胸腺細胞,正常,凋亡,胸腺細胞,正常,凋亡,細

7、胞凋亡的生化改變,1.DNA的片段化“梯”狀條帶2.內源性核酸內切酶激活及其作用3.凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用,1.DNA的片段化“梯”狀條 帶為細胞凋亡主要特征,①幾乎所有凋亡細胞均有核小體間的裂 解，導致DNA 的斷裂；②DNA降解過程的特異性：不伴有組蛋 白和其它核蛋白的降解；③染色質在核小體間的裂解是凋亡細胞 和形態(tài)改變的基礎；④DNA 片段化是凋亡的“黃金標記”。,2.內源性核

8、酸內切酶激活及其作用,由一系列胞內信號轉導環(huán)節(jié)激活，執(zhí)行染色質DNA切割,3. Caspase 9 激活，需要通過CARD（caspase-recruitment domain)、Apaf-1、細胞色素c、ATP等多個因子的參與,1.滅活細胞凋亡的抑制物（如Bcl-2）；2.水解細胞的蛋白質結構，導致細胞解體，形成凋亡小體（apoposis boby）；3.在凋亡級聯(lián)反應中水解相關活性蛋白，使該蛋白獲得或喪失某種生物學功能,Cas

9、pases在凋亡中的主要作用,細胞凋亡的調控,（一）細胞凋亡相關因素 1.誘導性因素 2.抑制性因素 (二) 細胞凋亡信號的轉導,1.細胞凋亡的誘導因素,.生理活性因子：TNF家族（Fas-L,TNF)、 TGF、神經遞質(谷氨酸、多巴胺)、生長因子撤退、GC等 .損傷相關因

10、子：熱休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射線等.化療藥物.毒素：乙醇、β -淀粉樣肽,2.細胞凋亡的抑制因素,.凋亡相關基因的抑制作用：p53、bcl-2、bcl-XL等。.生理性抑制劑：生長因子、細胞外基質、鋅、雄激素、雌激素等.病毒基因：腺病毒E1B、桿狀病毒p35、棒狀病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBV BHRF1等.藥物：Calpain抑制劑、caspases抑制劑、促癌劑、佛波豆蔻乙脂(PMA)等,(二)

11、細胞凋亡信號的轉導 -凋亡信號轉導系統(tǒng)特點,① 多樣性：不同種類的細胞系統(tǒng)不同② 偶聯(lián)性：與增殖分化的信號系統(tǒng)交叉偶聯(lián)③ 同一性：多因素，共用同一系統(tǒng)觸發(fā)④ 多途性：同一誘導因素啟動多條信號轉導途徑,㈡細胞凋亡信號的轉導,誘導信號,,cell,R,,,神經酰胺,,,,多途徑,R,SAPK/JNK,,P53 基因,,NF-kB,JNK/AP-1途徑,,激活bax or 下調bcl-2,,,,ROS,mtDNA,,

12、㈢ 細胞凋亡相關基因,抑制凋亡基因：bcl-2促進凋亡基因： fas，P53雙向調控基因： c-myc，bclx,Bcl-2抗凋亡機制,①直接的抗氧化②抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質③抑制促凋亡的Bax，Bak細胞毒作用④抑制Caspases激活⑤維持細胞鈣穩(wěn)態(tài),細胞凋亡發(fā)生機制,（一）氧化損傷（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡 (三) 線粒體損傷,（一）氧化損傷機制,氧自由基可破壞機體正常的氧化/還原的動態(tài)平衡，造成生物大分子的氧化

13、損傷，干擾正常的生命活動，形成嚴重的氧化應激狀態(tài)——后果：誘導細胞凋亡。,（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細 胞凋亡的可能機制,1.激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內切酶(DNase)，降解DNA鏈；2.激活谷氨酰胺轉移酶，催化細胞內肽鏈間的?；D移，在肽鏈間形成共價鍵，使細胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成；3.激活核轉錄因子，加速細胞凋亡相關基因的轉錄；4.Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈舒展，暴露出核

14、小體之間的連接區(qū)內的酶切位點，有利于DNA內切酶切割DNA。,細胞凋亡的生物學意義,1.發(fā)育 從低等動物到高等動物的發(fā)育，都存在著程序性細胞死亡的現(xiàn)象。2.免疫系統(tǒng) 淋巴細胞發(fā)育分化成熟過程中，始終伴隨著細胞凋亡。3.衰老 細胞凋亡與許多年齡相關疾病有直接或間接的聯(lián)系。4.損傷與修復 5.腫瘤發(fā)生 細胞增殖與死亡的速度平衡失調。6.病毒致病 病毒表達抗凋亡蛋白。,細胞凋亡的檢測,隨著研究技術的提高和對凋亡的認識不斷深入，檢

15、測凋亡的方法已從細胞、染色質到分子水平日趨完善和成熟。1.形態(tài)學檢測2.DNA降解分析3.凋亡酶學分析4.凋亡相關蛋白分析5.流式細胞分析,一．細胞凋亡的形態(tài)學分析,細胞凋亡的形態(tài)學變化主要表現(xiàn)為：細胞皺縮(cell shrinkage)，失去細胞連接(cell junction)，微絨毛(microvilli)消失，發(fā)泡(blebbing)，染色質濃集并靠近核膜，形成沿核膜收縮的新月狀體(crescents)，形成凋亡小體(

16、apoptotic body)等。,細胞凋亡的形態(tài)學檢測方法,二. DNA降解分析,DNA降解過程的特點：1. 發(fā)生于凋亡早期，由內源性核酸內切酶激活引起2. DNA在核小體連接部位斷裂，產生180－200bp為最小單位的單體或寡聚體片斷3. DNA碎片可被細胞膜包裹，形成凋亡小體,,(一) DNA凝膠電泳 原理：凋亡細胞降解產生一系列規(guī)則的DNA片斷，其電泳結果呈典型的“ 梯狀帶”(ladder)；而壞死或凋

17、亡后壞死細胞的DNA分解是隨機的，產生的碎片分子量大小不一，在電泳時形成“ 涂片狀”(smear)。 普通瓊脂糖凝膠電泳、Southern blotting、放射自顯影(32PdATP或32PdCTP連接到DNA片斷的3’ 端),(二)原位標記法TUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling)終末脫氧核糖核苷酸轉移酶介導的原位缺口末端標記技術。原理：在TdT的作用下，帶有標記物的d

18、UTP被連接在斷裂DNA3’末端，然后通過相應的方法檢測標記物，從而判斷是否有凋亡發(fā)生。應用范圍：石蠟包埋的組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)細胞、組織中分離的細胞,(三) ELISA法 原理：以抗組蛋白抗體包被微孔板壁，加入標本，凋亡細胞的核小體可與抗體結合，再加入抗-DNA片斷-POD復合物，與核小體中的DNA片斷結合，最后加入POD顯色底物，以酶標儀測定光密度以進行定量分析。,三. 凋亡酶學分析,1. 內切核酸酶(e

19、ndonuclease, DNase) 種類：DNase Ⅰ （內質網(wǎng)、高爾基體), DNase Ⅱ（溶酶體、胞核)，NUC18（胞核，胸腺細胞中) 等 作用：使DNA斷裂成180－200bp或其倍數(shù)的片斷 激活機制：CAD(caspase-activate DNase) ICAD(inhibtor of CAD) 檢測：Western Bl

20、otting,Caspases的檢測 1. Caspase-3活性測定(FIENA法) 熒光測定免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay, FIENA), caspase-3可作用于連接熒光素的特異底物－乙酰化天冬氨酸-谷氨酸-頡氨酸-天冬氨酰胺(Ac-DEVD), 產生發(fā)熒光的裂解產物AFC，且caspase-3活性與Ac-DEVD-AFC分解的量或自由熒光A

21、FC產生熒光的強弱成正比，故可定量檢測 2. 蛋白印跡法 Caspases作用底物的檢測 PARP89kD的檢測,四. 凋亡相關蛋白分析,1. Bcl-2家族 促進凋亡：Bax, Bal, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, Bim, Hrk, Bok等 抑制凋亡：Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl-1等 均含有BH(Bc

22、l-2 homology)結構域，通過此結構域以二聚體形式調控凋亡。2. 其他相關蛋白 p53, Myc, Fas等,五、流式細胞分析,（Flow Cytometry，F(xiàn)CM） 利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術。,FCM分析細胞凋亡的方法,一. 細胞形態(tài)分析二. 細胞膜結構與功能改變分析三. 細胞DNA含量分