自身凋亡-壞死細胞對體內(nèi)調節(jié)性T細胞的影響.pdf

1、凋亡（apoptosis）和壞死（necrosis）是細胞的兩種主要死亡方式。細胞凋亡又稱程序化死亡，是生物體內(nèi)普遍存在的生理和病理現(xiàn)象，其特點是細胞主動的、程序化的和耗能的死亡，表現(xiàn)為核固縮、細胞皺縮、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻、凋亡小體形成，同時凋亡細胞或凋亡小體在體內(nèi)被迅速清除，不引起炎癥反應。壞死是細胞受到化學、物理或者生物等外界環(huán)境因素的傷害而引起非程序化的、被動的和破壞性的細胞死亡過程，其

2、表現(xiàn)為細胞能量代謝中止，細胞膜通透性增高，細胞腫脹或破裂、細胞核固縮或碎裂，內(nèi)容物釋放到周圍組織中去，引起炎癥反應。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，凋亡細胞在體內(nèi)不僅僅是被清除，而且還會釋放或者促進吞噬細胞釋放大量的“抗炎性因子”，激活一系列信號途徑，最終下調免疫反應，誘導免疫耐受。目前，已經(jīng)證實，凋亡細胞在自身免疫、腫瘤免疫、感染免疫以及移植免疫等過程中均發(fā)揮重要的作用。凋亡細胞吞噬障礙可以引起自身免疫病，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展也與凋亡異常有關，

3、供體凋亡細胞還能夠誘導嚙齒類動物的移植免疫耐受。但是，目前對于凋亡細胞誘導免疫耐受在機制還不是很清楚。 與凋亡細胞不同的是，壞死細胞可以啟動免疫應答反應。壞死細胞在體內(nèi)被吞噬后，可以促進樹突狀細胞的活化（dendritic cell，DC）；壞死細胞與巨噬細胞（macrophage，M（））共培養(yǎng)后，可以提高巨噬細胞的抗腫瘤能力，壞死細胞同時可以刺激M（）分泌大量炎性因子。此外，壞死細胞本身也會釋放“危險信號”，活化固有免疫，啟

4、動免疫反應。 凋亡和壞死同為細胞死亡方式，對免疫系統(tǒng)的影響卻如此不同，這也引起了普遍關注。凋亡和壞死兩者之間到底有什么樣的聯(lián)系，目前還未有定論。就當前研究進展來看，調節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）在凋亡誘導的免疫耐受中起著非常重要的作用。Treg是一組具有抑制其它免疫細胞功能的免疫調節(jié)細胞，現(xiàn)已被證明在各種不同免疫反應的調節(jié)過程中都不可或缺。有實驗證實靜脈輸注凋亡細胞可以升高Treg，而去除Treg后

5、，凋亡細胞將不能誘導免疫耐受。此外，Treg的產(chǎn)生和增長都依賴轉化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β），而凋亡細胞被吞噬后恰好會產(chǎn)生大量的TGF-β。然而，壞死細胞與Treg的關系目前還不清楚。 凋亡細胞誘導免疫耐受的作用現(xiàn)在被相當多的免疫學研究者寄望于解決移植排斥問題，但是目前僅僅在嚙齒類動物上有良好的進展。在大動物尤其是非人靈長類動物上，還未有突破。關鍵在于目前對凋亡/壞死作用于免

6、疫系統(tǒng)的很多機制沒搞清楚。Treg的發(fā)現(xiàn)和凋亡細胞誘導免疫耐受研究的進展，無疑是對原有免疫學“克隆選擇學說”理論的重大挑戰(zhàn)。顯然，進一步在靈長類動物上研究凋亡細胞和Treg的關系，將有利于探討凋亡細胞誘導免疫耐受的臨床研究；而同時研究壞死細胞和Treg的影響，則有助于理解不同方式死亡的細胞對免疫耐受和免疫應答平衡的不同調節(jié)作用，并掌握不同死亡細胞調節(jié)免疫的關鍵細胞和關鍵分子，從而為臨床上有效地調控免疫反應提供思路。 目的：

7、 1.研究誘導恒河猴外周血單個核細胞凋亡的方法； 2.觀察凋亡細胞聯(lián)合雷帕霉素對恒河猴體內(nèi)Treg的影響； 3.研究壞死細胞對小鼠體內(nèi)Treg的作用，以及H2O2處理后的壞死細胞對Treg的影響。 方法： 1.抽取恒河猴靜脈血，梯度密度分離法分離外周血單個核細胞。采用紫外線照射法誘導凋亡，摸索不同照射時間、不同孵育時間以及是否照射時增加震蕩等誘導凋亡的條件。細胞凋亡率的判斷使用異硫氰熒光素（fluore

8、scein isothiocyannate，F(xiàn)ITC）標記的鈣磷脂結合蛋白V（Annexin V）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色，流式細胞儀檢測。 2.四只恒河猴分為兩組，實驗組每天給予口服0.4mg雷帕霉素，并靜脈輸注凋亡細胞一次，細胞數(shù)目約3.5×107個；對照組每天給予同樣劑量雷帕霉素，并注射PBS一次。定期檢測各組恒河猴外周血中CD4+Foxp3+Treg，并計算Treg占CD4+T細胞的比例。

9、對比兩組恒河猴Treg變化曲線的異同。 3.將36只6周齡SPF級Balb/C小鼠隨機分為四組。第一組為壞死細胞組（n=10），尾靜脈注射2×107個（200μl）未經(jīng)任何處理的壞死細胞；第二組為H2O2處理壞死細胞組（n=10），尾靜脈注射50mM H2O2處理后的壞死細胞2×107個；第三組為PBS+H2O2對照組（n=10），尾靜脈注射含50mM H2O2的PBS200μl；第四組為空白對照組（n=6），不做任何處理。2周

10、后處死小鼠，檢測外周血、脾臟、胸腺中CD4+ Foxp3+ Treg，并計算Treg占CD4+T細胞的比例。統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0軟件進行單向方差分析，分別比較各組間外周血、脾臟和胸腺中的Treg比例和Treg占CD4+T細胞的比例有無差異，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（X±SD）表示。 （1）壞死細胞的制備 5周齡SPF級Balb/C小鼠3只，處死后迅速取出胸腺研磨，PBS洗滌制備細胞懸液并計數(shù)。調整細胞濃度后56℃

11、水浴1小時。壞死率判斷使用Annexin VFITC和PI染色，流式細胞儀檢測。 （2）調節(jié)性T細胞檢測 采用美國eBioscience公司推薦的Treg檢測方法，抗小鼠CD4單克隆抗體標記后，eBioscience公司專用打孔/固定液處理細胞，每份樣本再分為兩管，一管加入抗小鼠Foxp3單克隆抗體，另一管加入同型對照IgG2b。4℃避光孵育1小時后流式細胞儀檢測。 結果： 1.紫外線（UVC）照射法誘導

12、恒河猴外周血單個核細胞凋亡。采用RPMI1640培養(yǎng)基加10%小牛血清重懸細胞，紫外線20cm距離照射1小時，同時震蕩細胞，然后孵育15小時可獲得滿意凋亡率?？偟蛲雎试?5%以上。 2.凋亡細胞聯(lián)合雷帕霉素升高恒河猴體內(nèi)CD4+Foxp3+Treg占CD4+T細胞的比例。單純口服雷帕霉素的兩只恒河猴，Treg/CD4+T比例在一只猴未見有明顯增加，在第38天為6.92%，另一只僅在4周后明顯增加，在第38天為13.7%；而注射凋

13、亡細胞聯(lián)合雷帕霉素組的兩只恒河猴，其Treg/CD4+T的比例在輸注凋亡細胞后大約2-3周即有明顯增加，兩只猴在第38天Treg/CD4+T細胞比例升至16.67%和21.56%。 3.壞死細胞處理后小鼠CD4+Foxp3+Treg的比例。 應用不同的處理方法處理小鼠后兩周，檢測小鼠不同淋巴組織中的小鼠CD4+Foxp3+Treg占淋巴細胞比例。結果發(fā)現(xiàn)：在脾臟中，空白對照組為（3.80±0.24）%，PBS+H2O2對

14、照組為（3.41±0.64）%，壞死細胞組為（2.75±0.38）%。壞死細胞組與空白對照組和PBS+H2O2對照組相比顯著降低（F=6.895，Pvs空白=0.000，Pvs PBS+H2O2=0.004）。而H2O2處理壞死細胞組為（3.42±0.49）%，與壞死細胞組相比顯著增高（F=6.895，P=0.004），但與空白對照和PBS+H2O2對照組相比無顯著差異（F=6.895，Pvs空白=0.139，PvsPBS+H2O2=0

15、.948）。表明H2O2處理后的壞死細胞消除了后者降低CD4+Foxp3+Treg的作用。在外周血和胸腺中，均未見各組間有統(tǒng)計學差異（Fblood=0.337，Pblood=0.799； Fthymus=0.507，Pthymus=0.680）。CD4+T細胞占淋巴細胞比例：在小鼠外周血、脾臟、胸腺中，各組CD4+T細胞占淋巴細胞比例未見統(tǒng)計學差異。 然后我們觀察了CD4+Foxp3+ Treg占CD4+T細胞比例：外周血中，空

16、白對照組為（7.09±1.93）%，PBS+H2O2對照組為（8.46±2.48）%，壞死細胞組為（6.19±1.62）%，H2O2處理壞死細胞組為（6.34±1.05）%。空白對照組與PBS+H2O2對照組無統(tǒng)計學差異（F=2.887，P=0.166）。壞死細胞組與H2O2處理壞死細胞組相比PBS+H2O2對照組均有顯著降低（F=2.887，P壞死=0.013，PH2O2+壞死=0.020）。在脾臟，空白對照組為（16.74±1.54

17、）%，PBS+H2O2對照組為（14.16±3.27）%，壞死細胞組為（10.15±2.64）%，壞死細胞組與空白對照組或PBS+H2O2對照組相比均顯著降低（F=8.482； Pvs空白=0.000，Pvs PBS+H2O2=0.002）；H2O2處理壞死細胞組為（12.81±2.44）%，比壞死細胞組有增高（F=8.482，P=0.043），但仍低于空白對照組水平（F=8.482，P=0.007）。在胸腺未見各組間具有統(tǒng)計學差異（F