土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定及淀粉酶活的測定

1、土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定及淀粉酶活的測定土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定及淀粉酶活的測定摘要：從飯?zhí)瞄T口和生化樓樓下的土壤中分離、純化、培養(yǎng)獲得七個菌株，其中五個為能分泌淀粉的芽孢桿菌，通過一系列生理生化實(shí)驗(yàn)，對其中兩個菌株的種屬進(jìn)行了初步鑒定，并對其中一株菌所產(chǎn)的淀粉酶活力進(jìn)行了測定。關(guān)鍵字關(guān)鍵字：土壤芽孢桿菌淀粉酶鑒定活力土壤微生物類群在全球自然生態(tài)系統(tǒng)中具有不可替代的作用它推動著生態(tài)系統(tǒng)的能量流動和物質(zhì)循環(huán)維持生態(tài)系統(tǒng)

2、的正常運(yùn)轉(zhuǎn)是生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分在土壤中的分布既反映土壤、植物和氣候等綜合因素對微生物的影響和作用同時其生命活動也反映出土壤肥力、土壤改良與植物營養(yǎng)的密切關(guān)系。芽孢桿菌是土壤細(xì)菌中最具活力的部分之一也是土壤細(xì)菌的主要種群之一。本實(shí)驗(yàn)通過小組合作，由老師指導(dǎo)，小組自行設(shè)計、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對土壤微生物進(jìn)行分離、純化及鑒定，發(fā)酵及產(chǎn)物測定，對學(xué)生的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰M(jìn)行一個比較全方面的鍛煉和培養(yǎng)。（1）了解微生物分離純化的原理及微生物分離純化常用方法和

3、技術(shù)；（2）掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理及方法；（3）掌握微生物的搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測定的原理及方法；（4）培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計實(shí)驗(yàn)流程、綜合分析解決問題及判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力；（5）對所學(xué)習(xí)過的微生物實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行綜合技能訓(xùn)練；（6）從不同環(huán)境土壤樣品中篩選出能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，并分析比較各產(chǎn)淀粉酶菌株的產(chǎn)淀粉酶活力及總結(jié)各芽孢桿菌在土壤中的分布情況。1.原理及方法概述原理及方法概述1.1原理原理1.1.1芽孢桿菌芽孢桿菌1.1

4、.1.1形態(tài)學(xué)特性：形態(tài)學(xué)特性：芽孢桿菌細(xì)胞呈直桿狀，0.52.5μm1.210μm，常以成對或鏈狀排列，具圓端或方端。細(xì)胞染色大多數(shù)在幼齡培養(yǎng)時呈現(xiàn)革蘭氏陽性，以周生鞭毛運(yùn)動。芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，能抗許多不良環(huán)境。1.1.1.2生理學(xué)特性：生理學(xué)特性：芽孢桿菌屬，革蘭氏陽性，嚴(yán)格需氧或兼性厭氧的有莢膜的桿菌。多數(shù)為腐生菌主要分布于土壤、動植物體表及水體中。該屬細(xì)菌的重要生理特性是能夠產(chǎn)生對對熱、pH和鹽各種多樣性的不利條件具有

5、特殊抵抗力的芽孢。生孢不被氧所抑制。發(fā)現(xiàn)于不同的生境，少數(shù)種對脊椎動物和非脊椎動物致病。）1.1.2淀粉酶淀粉酶淀粉酶是催化淀粉水解的一類酶的總稱，廣泛存在于動物、植物和微生物中。目前生產(chǎn)應(yīng)用的淀粉酶主要來源時，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強(qiáng)酸性（低于細(xì)菌菌體等電點(diǎn)），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。1.2.3芽孢染色芽孢染色細(xì)菌的芽孢的形狀、大小和著生位置是鑒定的重要依據(jù)。芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般的染色

6、法只能使菌體著色而芽孢不著色。其方法就是根據(jù)芽孢既難以染色而一旦著色后又難以脫色這一特點(diǎn)而設(shè)計的。1.2.4革蘭氏染色革蘭氏染色它可以將所有細(xì)菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別性染色法，可以把它歸到生理生化鑒定上。其方法是先用結(jié)晶紫初染，再加媒染劑碘液以增加染料與細(xì)胞的親和力，使結(jié)晶紫和碘在細(xì)胞膜上形成相對分子質(zhì)量較大的復(fù)合物，然后進(jìn)行脫色（乙醇），最后用沙黃液復(fù)染。凡細(xì)菌不被脫色而保留初染劑的顏色者為陽性；

7、如被脫色后又染上復(fù)染劑顏色（紅色）者則為陰性。1.2.5淀粉水解試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)有些細(xì)菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)色。因此可用于篩選產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。1.2.6搖瓶發(fā)酵的測定原理搖瓶發(fā)酵的測定原理（1）淀粉—水解（淀粉酶）—生成麥芽糖（還原糖）（2）在堿性條件下，還原糖與35二硝基水楊酸共熱，35二硝基水楊酸被還原為3氨基5硝基水楊酸(棕紅色物質(zhì))，還原糖則被

8、氧化成糖酸及其它產(chǎn)物。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度量呈一定的比例關(guān)系，在540nm波長下測定棕紅色物質(zhì)的吸光值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出樣品中還原糖的含量。（3）40℃時在5min內(nèi)水解淀粉釋放1mg麥芽糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）計算公式:酶活力單位（U）=C酶V酶n（C酶—酶液中麥芽糖的濃度V酶—提取液的總體積n—酶液的稀釋倍數(shù)）2.實(shí)驗(yàn)材料與用具實(shí)驗(yàn)材料與用具2.1材料材料土樣2種樣品1：生化樓樓下河道邊樣品

9、2：菊苑飯?zhí)煤箝T附近2.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基2.2.1牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏（3g）蛋白胨（10g）氯化鈉（5g）瓊脂（15g）蒸餾水（1000ml）pH7.27.42.2.2淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基（淀粉牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基）可溶性淀粉（2g）牛肉膏（3g）蛋白胨（10g）氯化鈉（5g）瓊脂（15g）蒸餾水（1000ml）pH7.27.42.2.3硝酸鹽培養(yǎng)基硝酸鹽培養(yǎng)基甲液（對氨基苯磺酸0.8g5molL