Anoxybacillus sp α-淀粉酶基因在巨大芽孢桿菌中的表達(dá).pdf

1、α-淀粉酶(EC3.2.1.1)能夠以淀粉做為底物，從淀粉內(nèi)部水解1，4-α-D葡萄糖苷鍵，因此也被叫做1，4-α-D-葡萄糖苷水解酶，它被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵、淀粉糖生產(chǎn)、造紙、紡織等行業(yè)，具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用稀釋分離的方法從云南騰沖溫泉篩選出一株可水解淀粉的嗜熱細(xì)菌GXTC-3，該菌株革蘭氏染色為陽(yáng)性，細(xì)胞呈桿狀，最適生長(zhǎng)溫度為60℃-65℃，最適生長(zhǎng)pH為7.0-8.0。結(jié)合該菌株的生理生化特征和16SrRNA

2、基因序列在NCBI上的比對(duì)分析，初步鑒定為Anoxybacillussp.GXTC-3。用PCR的方法，從Anoxybacillussp.GXTC-3中擴(kuò)增出α-淀粉酶基因，測(cè)序驗(yàn)證后加入酶切位點(diǎn)，然后與表達(dá)載體pHIS1525連接轉(zhuǎn)化大腸桿DH5α，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子DH5α-pHIS1525-JH并提取質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化巨大芽孢桿菌YYBml原生質(zhì)體，獲得基因工程菌YYBml-pHIS1525-JH。經(jīng)SDS-PAGE分析表明該基因在巨大

3、芽孢桿菌中得到了有效表達(dá)。重組酶經(jīng)鎳柱等純化后，酶學(xué)性質(zhì)研究表明：該酶的最適溫度與pH值分別為60℃與pH8.5，在pH7.0-10.5之間具有很好的穩(wěn)定性，Km值為1.94mg/mL，酶活力可達(dá)2516.5U。金屬離子Cu2+、Fe3+、Hg2+、Ag+對(duì)酶活有明顯的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用可使酶基本失活，Zn2+、Co2+、Fe2+、Ba2+對(duì)酶活的抑制作用則相對(duì)比較小，而Ca2+、Na+、Mg2+、K+、巰基乙醇對(duì)酶活有微

4、弱的激活作用，一些金屬離子如Li+、Mn2+則對(duì)酶活幾乎不產(chǎn)生影響。HPLC分析表明Anoxybacillussp.GXTC-3α-淀粉酶可水解淀粉產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的混合物，而對(duì)α環(huán)糊精和β環(huán)糊精基本不起作用。
　　 巨大芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)較新穎的表達(dá)系統(tǒng)，比大腸桿菌等表達(dá)系統(tǒng)具有很多的優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)還初步優(yōu)化了巨大芽孢桿菌YYBml工程菌的培養(yǎng)條件，結(jié)果表明：該基因工程菌的最適碳源與氮源分別為果糖和酵母膏，在表面