高效毛細管電泳

1、1,第十章 高效毛細管電泳法,,電泳是溶液中帶電粒子在電場力作用下，以不同的速度向電荷相反方向遷移的現(xiàn)象。利用這種現(xiàn)象對化學和生物化學組分進行分離分析的方法稱之為電泳法。,傳統(tǒng)電泳最大的局限性是難以克服由兩端的高電壓所引起的電介質(zhì)離子流的自熱，或稱焦耳熱, 從而導致區(qū)帶展寬，影響遷移，降低效率, 因此極大地限制了高壓的使用.當然也就難以加快整個過程的速度。,2,毛細管電泳（ capi1lary electrphoresis，CE）和傳

2、統(tǒng)電泳的根本區(qū)別在于前者設法使電泳過程在散熱效率極高的毛細管內(nèi)進行，從而確保引入高的電場強度，全面改善分離質(zhì)量。,20世紀30－40年代 蒂塞利烏斯(A.W.K.Tiselius）建立了移動界面電泳，將電泳發(fā)展成分離技術 獲得1948年諾貝爾化學獎,3,l967年Hjerten最先提出在高電場強度，直徑為3mm的毛細管中作自由溶液的毛細管區(qū)帶電泳，開創(chuàng)了CE的先

3、河。,1981年，J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs實驗上和理論上為毛細管電泳的發(fā)展奠定了基礎。,1988~89年，商品化的毛細管電泳儀推出，毛細管電泳法迅速發(fā)展起來。,第一節(jié) 毛細管電泳的特點和分類,一、電泳和色譜,1.分離原理,4,電泳是溶液中帶電粒子在電場力作用下發(fā)生定向運動，因粒子所帶電荷數(shù)、形狀、大小等不同，導致不同的遷移速度而分離。色譜是不同組分在流動相的推動下，由于在固定相流動相中的分配系數(shù)不同，導致不

4、同的遷移速度而分離。但某些毛細管電泳的分離模式也包含了色譜的分離機制。,2.分離過程,電泳和色譜的分離過程都是差速遷移過程，可用相同的理論來描述。色譜中所用的一些名詞概念和基本理論，如保留值、塔板理論、速率理論等均可借用于毛細管電泳中。,5,3.儀器流程,6,二、毛細管電泳的特點,1. 柱效高,高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數(shù)百萬。,色譜儀和電泳儀（HPLC和CE），都包括進樣部分、

5、分離柱、檢測器和數(shù)據(jù)處理等。,2.消耗低,CE所需樣品為nl級, 流動相用量也只需幾毫升, 而HPLC所需樣品為μl級, 流動相則需幾百毫升乃至更多。,7,3.速度快,一般幾十秒至十幾分，最多半小時，即可完成一個試樣的分析。,4.應用廣泛,通過改變操作模式和緩沖液的成分，CE有很大的選擇性，可以根據(jù)不同的分子性質(zhì)，對極廣泛的對象進行有效的分離。,CE分離有機分子、藥物分子，特別是手性分子和生物大分子方面的能力，對HPLC地位提出了嚴峻

6、的挑戰(zhàn)。,8,三、毛細管電泳的分類,按分離模式分類，常用的ＣＥ技術有六種：,毛細管區(qū)帶電泳，膠束電動毛細管色譜，毛細管凝膠電泳，毛細管等電聚焦，毛細管等速電泳 ，毛細管電色譜,毛細管區(qū)帶電泳是CE中最基本、應用最普遍的一種模式。,第二節(jié) 基本原理,一、電泳和電泳淌度,1. 電泳與電泳速度,9,在一定電場強度作用下，溶質(zhì)帶電粒子在溶液中的定向移動（遷移），這種現(xiàn)象稱為電泳。帶電粒子在電場中遷移時，所受的電場力為,q: 溶質(zhì)離子

7、所帶的有效電荷 E: 電場強度,帶電粒子在溶液中運動時受到的阻力即摩擦力為,,,,是電泳速度,10,f為摩擦系數(shù)，其大小與帶電粒子的大小、形狀以及介質(zhì)粘度有關。對于球形離子，f = 6πηγ；對于棒狀離子，f = 4πηγ。式中，γ是溶質(zhì)離子的動力學半徑，η是電泳介質(zhì)的粘度。,平衡時，電場力和摩擦力相等，即,qE = fvep,電泳速度為,11,不同物質(zhì)在同一電場中，由于它們的有效電荷、形狀大小的差異，它們的電泳速度不同，所以可能實現(xiàn)

8、分離,我們把溶質(zhì)在給定溶液中和單位電場強度下的電泳速度稱為電泳淌度，用μep表示。,2．電泳淌度,12,所以淌度不同是電泳分離的內(nèi)因和前提。,溶質(zhì)粒子的電泳速度決定于粒子淌度和電場強度的乘積，,vep ＝μepE,在一定條件下，不同粒子的形狀、大小以及所帶電量都可能有差別，則電泳淌度也可能不同。,（1）絕對淌度（μab） 是在無限稀釋時單位電場強度下離子的平均遷移速度，它是該離子在一定溶液中的一個特征物理常數(shù)。,13,（2）有效淌度（

9、μef） 我們不可能在無限稀釋而又沒有其它離子、酸度等影響下進行工作，有效淌度是實際的離子電泳淌度。,（3）表觀淌度（μap） 在有電滲存在下，測得的實際離子淌度稱為表觀淌度或凈淌度，是有效淌度μef和電滲淌度μos的矢量和。,,,μap=μos±μef,14,,二、電滲和電滲流,1．電滲現(xiàn)象,當固體與液體相接觸時，如果固體表面因某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶相反電荷，當液體兩端施加一定電壓時，就會發(fā)生液體

10、相對于固體表面的移動，這種現(xiàn)象叫做電滲。,,,,,15,高效毛細管電泳大多使用石英毛細管，在內(nèi)充緩沖液PH>2時，管壁的硅醇基（－SiOH）離解成硅醇基陰離子（－SiO－），使管壁帶負電荷，溶液帶正電荷，在管壁和溶液之間形成雙電層。,Zeta電位,16,由于溶液中的陽離子實際上是溶劑化的，在外電場的作用下，溶劑化的陽離子向負極移動，將引起柱中的溶液整體向負極移動，這就是毛細管電泳中的電滲現(xiàn)象。,2。電滲流（electroosmot

11、ic flow，EOF）,電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流。,17,3. 電滲流的大小和方向,電滲流的大小用電滲流速度vos表示，其大小決定于電滲淌度μos和電場強度E。即,ε、η－分別是電泳介質(zhì)的介電常數(shù)和粘度, ζ－毛細管壁的Zeta電位，它近似等于擴散層與緊密層界面上的電位。該界面內(nèi)凈電荷數(shù)（正電荷數(shù)）越多、擴散層越厚，Zeta電位越大.,18,Lef—毛細管有效長度； tos—電滲流標記物（中性物質(zhì)）的遷移時間。,電滲流

12、的速度是電泳速度的5～7倍。,一般情況下，石英毛細管內(nèi)壁表面帶負電荷，則電滲流帶正電荷，向負極移動。但如果將毛細管內(nèi)壁改性，比如在在內(nèi)壁表面涂漬或鍵合一層陽離子表面活性劑，將使壁表面帶正電荷，則電滲流帶負電荷，向正極移動。,VOS可通過實驗測定,19,在外電場驅(qū)動下產(chǎn)生的電滲流為平流，即塞式流形。液體流動速度除在管壁附近因摩擦力迅速減小到零以外，其余部分幾乎處處相等。這一點和HPLC中靠泵驅(qū)動的流動相的流形完全不同。,4.電滲流的流形,

13、20,HPLC流動相的流形為拋物線形的層流，在管壁處的速度為零，管中心的速度是平均速度的2倍，引起的譜峰展寬較大。,電滲流呈平流，引起的譜峰展寬很小，是毛細管電泳能獲得較HPLC更高分離效率的重要原因。,4. 電滲流的作用,電滲流通常流向負極，電滲流速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍。所以，各種電性物質(zhì)在毛細管中的遷移速度為兩種速度的矢量和，稱為表觀電泳速度，用vap表示。,21,22,陽離子： vap＝vos+vef陰離子：

14、 vap＝vos－vef中性分子： vap＝vos,當把試樣從陽極端注入到毛細管內(nèi)時，不同電性的粒子將按不同的速度向負極遷移，從負極端先后流出毛細管。出峰次序是： 陽離子>中性分子>陰離子中性分子與電滲流速度相同，不能互相分離。,vap=μapE=(μos±μef)E,23,①電滲流具有像HPLC中泵一樣的作用，推動離子前進，加上不同離子電泳速度和方向的差異，完成陽離子、陰

15、離子和中性離子的分離。,②改變電滲流的大小和方向，可以改變分離效率和選擇性。這是HPCE中優(yōu)化分離的重要因素。,電滲流在HPCE 的分離中起著極其重要的作用：,③電滲流的微小變化影響分離結(jié)果的重現(xiàn)性（遷移時間和峰面積） 。,電泳中影響電滲流的因素很多，應設法控制電滲流的恒定。,24,三、HPCE中影響電滲流的因素,1.電場強度的影響 電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。,2.毛細管材料

16、的影響,酸度影響毛細管的表面Si-OH基的電離，特別是在pH4～7范圍內(nèi)，影響更顯著，此時溶液pH值與EOF成近線性關系,25,3. 電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響,（1）溶液pH的影響 對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達到最大； pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）緩沖液陰離子的影響 在其他條件

17、相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。,26,緩沖溶液離子強度，影響雙電層的厚度、溶液粘度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液濃度增加，離子強度增加，電滲流下降。,（3）緩沖液濃度（離子強度）的影響,27,28,4. 溫度的影響,毛細管內(nèi)溫度的升高，使溶液的粘度下降，電滲流增大。 溫度變化來自于“焦耳熱” 焦耳熱：毛細管溶液中有電流通過時，產(chǎn)生的熱量； HPCE中的焦耳熱與

18、背景電解質(zhì)的摩爾電導、濃度及電場強度成正比。 溫度每變化1度，將引起背景電解質(zhì)溶液粘度變化2%～3%；,29,5. 添加劑的影響,（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強度增大，電滲流減小。,（2）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向 某些陽離子表面活性劑使電滲流減小，某些陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負電荷增加，電滲流增大（3）加入有機溶劑如甲醇、乙腈，使溶液的粘度減小，電

19、滲流增大。,30,31,四、柱效和分離度,（一）理論塔板數(shù)和塔板高度,用理論塔板數(shù)n和塔板高度H表示柱效。n可以直接由電泳圖求出,tm為起點到譜峰最高點所對應的時間，稱為遷移時間。因為毛細管中，沒有固定相，不存在組分在固定相中分配和保留。,32,塔板高度H為：,Lef為進樣口到檢測器的距離, 為有效柱長.檢測器在柱上，Lef<L,（二）譜帶展寬,在理想的情況下，縱向擴散是HPCE中導致譜帶展寬的唯一因素。根據(jù)范第母特方程,1. 縱

20、向擴散,D是溶質(zhì)組分的擴散系數(shù),33,V是電壓，L是毛細管全長。,縱向擴散與擴散系數(shù)成正比，與表觀電泳速度成反比。Vap小，tm長，譜峰展寬。,若只考慮縱向擴散，則理論塔板數(shù)為,由上式可知，n與電場強度E（或電壓V）成正比，與溶質(zhì)的擴散系數(shù)成反比。,大分子比小分子擴散系數(shù)小，可以獲得更高的分離效率。,34,在HPCE中，溶質(zhì)在幾萬至十幾萬伏的電壓下，遷移速度較快，縱向擴散小，柱效高。,在實際電泳過程中，出了溶質(zhì)的縱向擴散外，還存在很多引

21、起譜峰展寬的因素，如焦耳熱、吸附等。,2. 焦耳熱,電流通過毛細管內(nèi)緩沖溶液時產(chǎn)生自熱，稱焦耳熱。焦耳熱通過管壁向周圍環(huán)境散熱，管中心溫度最高，由中心向管壁溫度逐漸下降。溫度高粘度小，因而管中心的遷移速度最快，管壁附近的遷移速度最慢，破壞了溶質(zhì)帶的扁平流輪廓，導致溶質(zhì)區(qū)帶展寬。,35,,小內(nèi)徑毛細管散熱面積大，溫度梯度小，譜峰展寬小。但是，內(nèi)徑過細會帶來檢測、進樣等方面的一系列困難，又易造成柱的堵塞。因此目前采用的多是內(nèi)徑25～75μm

22、柱子。,采用低淌度緩沖液，如Tris [三-（羥基甲基）氨基甲烷]等。這種粒子的質(zhì)荷比很大，可以減小工作電流。,采用溫度控制裝置，盡快除去熱量，使系統(tǒng)盡可能地保持恒溫，是目前常采用的辦法。冷卻溫控的方法有兩種，氣冷和液冷，一般條件下，用氣冷已可以滿足要求。,36,3. 吸附,毛細管內(nèi)壁對靠近內(nèi)壁的溶質(zhì)粒子的吸附，使遷移速度減慢，導致譜峰變寬。造成管內(nèi)壁表面吸附的主要原因有兩個:,①在電解質(zhì)溶液PH大于3時，石英毛細管壁帶負電荷，因靜電引

23、力溶質(zhì)陽離子被管壁吸附。,②蛋白質(zhì)、多肽帶電荷數(shù)多，有較多的疏水基，有較強的疏水作用，被極性水溶劑向管壁擠壓，在PH小于3，管壁呈電中性時尤為明顯。,抑制或消除吸附的常用方法有：,37,（1）采用極端pH條件。即在低pH（2～3）或高pH（＞9）的緩沖液中進行CE分離，這樣可以抑制管壁硅醇基的離解或使被分析物質(zhì)帶負電，與管壁相斥，吸附受到抑制。,（2）對管壁內(nèi)表面加以修飾,（三）分離度,毛細管中的分離度也用R表示，可按譜圖直接由下式計算

24、：,38,分離度也可表示為柱效的函數(shù)：,39,影響分離度的主要因素①工作電壓V；②毛細管有效長度與總長度比；③相鄰兩組分的有效電泳淌度差；④表觀淌度。,40,第三節(jié) 毛細管電泳儀,毛細管電泳儀結(jié)構(gòu)比高效液相色譜儀 簡單。CE只需高壓直流電源、進樣裝置、毛細管和檢測器等。前三個部件均易實現(xiàn), 困難之處在于檢測器。,41,42,一、高壓電源,（1）0～30 kV 穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（

25、3）電場強度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；,二、電極槽,CE的電極通常由直徑0.5 ~ 1 mm的鉑絲制成，電極槽通常是帶螺口的小玻璃瓶或塑料瓶（1 ~ 5 mL不等），要便于密封。,43,三、進樣系統(tǒng),一般的進樣方式是電動進樣和壓力進樣。 1. 電動進樣 將毛細管柱的一端及其相應端的電極從緩沖池中移出，放入試樣杯中，然后在一準確時間范圍內(nèi)施加電壓，使試樣因離子移動和電滲流進入

26、毛細管柱。,通過此法直接由柱頭進人毛細管中的樣品量Q由下式給出:,,,44,進樣不均：淌度大的離子比淌度小的進樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進不去；特別適合粘度大的試樣；,2. 壓力進樣 （1）進樣端加壓 （2）出口端抽真空 （3）虹吸進樣,調(diào)節(jié)進樣槽和出口槽之間的相對高度使之產(chǎn)生虹吸作用，將樣品引入,45,進樣體積一般在納升級，進樣長度必須控制在毛細管總長度的1%~2%，否則將影響分離效率。,進樣量與組

27、分的淌度無關。因此，不存在上述電動進樣中的歧視效應。,46,四、毛細管柱,常用彈性石英毛細管，內(nèi)徑50μm和75μm兩種使用較多（毛細管電色譜有時用內(nèi)徑再大些的毛細管）。細內(nèi)徑分離效果好，且焦耳熱小，允許施加較高電壓，但若采用柱上檢測因光程較短，檢測限比較粗內(nèi)徑管要差。 毛細管長度稱為總長度，根據(jù)分離度的要求，可選用20～100cm長度，進樣端至檢測器間的長度稱為有效長度。,毛細管柱中充入緩沖溶液，柱的兩端置于兩個緩沖池中。

28、毛細管常盤放在管架上控制在一定溫度下操作。,47,48,五、檢測系統(tǒng),紫外-可見光分光檢測、激光誘導熒光檢測、電化學檢測和質(zhì)譜檢測均可用作毛細管電泳的檢測器，其中以紫外-可見光分光光度檢測器應用最廣。,將毛細管接近出口端的外層聚合物剝?nèi)ゼs2mm一段，使石英管壁裸露，毛細管兩側(cè)各放置一個石英聚光球，使光源聚焦在毛細管上，透過毛細管到達光電池, 實行柱上檢測。,六、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),與一般色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)基本相同。,49,50,第四節(jié) 分離模式

29、及其分離條件的選擇,一、毛細管區(qū)帶電泳（CZE）,毛細管區(qū)帶電泳也稱為自由溶液溶液區(qū)帶電泳, 這種電泳模式的特征是整個系統(tǒng)都用同一種緩沖溶液充滿，帶電粒子的遷移速度是電泳和電滲流速度的矢量和。,（一）分離原理,陽離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出。 中性粒子：無電泳現(xiàn)象，隨電滲流同行，在陽離子后流出。但不同結(jié)構(gòu)的中性分子無法相互分離。,51,陰離子：兩種效應的運動方向相反，ν電滲流 >ν電泳,陰離子在負極最后流出

30、。,CZE是最基本、應用最廣的分離模式,52,（二）分離條件的選擇,1．緩沖液,電泳過程在緩沖液中進行，緩沖液的選擇直接影響粒子的遷移和最后的分離.,緩沖液的選擇通常須遵循下述要求：,（l）在所選擇的pH范圍內(nèi)有很好的緩沖容量；,（2）在檢測波長處無吸收或吸收值低；,（3）為了達到有效的進樣和合適的電泳淌度，緩沖液的pH值至少必須比被分析物質(zhì)的等電點相差l個pH單位。,53,(5)只要條件允許就盡可能采用酸性緩沖液，在低pH值下，吸附和

31、電滲流都很小，毛細管涂層的壽命較長。,在配制毛細管電泳用的緩沖液時，必須使用高純蒸餾水和試劑，另外用前要用0.45μm的濾器過濾以除去顆粒等。,（4）自身的淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流的產(chǎn)生,54,一些常用緩沖溶液及其pKa值,55,2．添加劑,在CZE分離中，常常還在緩沖溶液中添加某種試劑，通過它與管壁或與樣品溶質(zhì)之間的相互作用，改變管壁或溶液相物理化學特性，進一步優(yōu)化分離條件，提高分離選擇性和分離度。,常用添加劑有表面活性

32、劑、有機溶劑、中性鹽類、兩性物質(zhì)和手性選擇劑等，,3．工作電壓,電壓是控制柱效n、分離度Rs和遷移時間tm的重要因素。在焦耳熱可以忽略的條件下，外加電壓增大，分離時間縮短、柱效和分離度提高.,56,但電壓升高，產(chǎn)生的焦耳熱增多，在不能有效地驅(qū)散所產(chǎn)生的焦耳熱情況下，柱溫顯著升高，工作電流增大，柱效和分離度降低。,除了采取有效的散熱措施外，選擇一種合適的條件，使在此條件下允許使用較高電壓，而不致產(chǎn)生過高的電流和過多的焦耳熱，是非常重要的。

33、,一般通過作I—V曲線來選擇體系的最佳外加電壓值。,57,58,59,二、膠束電動毛細管色譜（MECC或MEKC）,膠束電動毛細管色譜是在緩沖溶液中加入濃度高于膠束臨界濃度的表面活性劑，膠束相在分離中起到了準固定相的作用，是電泳技術與色譜技術的結(jié)合。,把離子型表面活性劑 (如十二烷基硫酸鈉)加到緩沖液中, 當其濃度超過臨界濃度后就形成有一疏水內(nèi)核、外部帶負電的膠束。雖然膠束帶負電, 但電滲流的速度仍大于膠束的遷移速度, 故膠束將慢速向負

34、極移動。,,（一）分離原理,60,61,中性粒子按其疏水性不同，在緩沖溶液（流動相）和膠束（準固定相）之間分配。疏水性強、親水性弱的粒子分配到膠束中的多，分配到緩沖溶液中的少；反之，親水性強、疏水性弱的溶質(zhì)分配到膠束中的少，分配到緩沖溶液中的多。當溶質(zhì)進入膠束時，以膠束的速度慢速遷移；溶質(zhì)進入緩沖溶液時，以電滲的速度快速前移。分配系數(shù)越大的粒子，在柱中遷移速度慢，從而使疏水性稍有差別的中性物質(zhì)在電泳中得以分離。,62,MECC的突出優(yōu)點

35、是除能分離離子化合物外，還能分離不帶電荷的中性化合物。,（二）分離條件的選擇,膠束準固定相對MECC分離過程起著重要作用。,準固定相為各類表面活性劑，對其要求是：,①膠束的粘度??；②水溶性好③形成的膠束必須均勻、透明，不吸收UV光 ④臨界膠束濃度CMC不宜太高⑤膠束具有足夠的穩(wěn)定性,63,一些常用的表面活性劑及其臨界濃度,64,65,三、毛細管凝膠電泳（CGE）,將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內(nèi)交聯(lián)生成一個細長的網(wǎng)狀多孔凝膠，其具有多

36、孔性，類似分子篩的作用。電荷/質(zhì)量比相等但大小不同的分子，在電場力的作用下發(fā)生遷移，其運動速度受到凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的阻礙。大分子受到的阻力大，移動速度慢，小分子受到的阻力小，移動速度快，從而使它們得以分離。 蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關，在CZE模式中，淌度幾乎沒有差別，很難分離，采用CGE能獲得良好分離，是研究DAN排序的重要手段。,66,酶解的雙螺旋DNA限制性片段的分離,67,四、毛細管電色譜（CEC）,