2015毛細(xì)管電泳

1、1,第一節(jié) 概述,電泳（Electrophoresis)是指溶液中帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向與自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。將電泳發(fā)展成為分離技術(shù)應(yīng)歸功于Tiselius (瑞典,蒂塞利烏斯)的工作。他于1937年建立“移界電泳（moving boundary electrophoresis)”，成功地將人血清中的蛋白質(zhì)分為白蛋白、α、β、和γ球蛋白，這項(xiàng)工作成為蛋白質(zhì)化學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)，因此Tiselius本人榮獲1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

2、,第15章 毛細(xì)管電泳法,,電泳（ C）槽和電極（ V1、V2 ）,2,,經(jīng)典電泳法散熱差，分離電壓受到限制。1981年，Jorgenson和Lukacs發(fā)表了在毛細(xì)管電泳發(fā)展史上具有劃時(shí)代意義的工作，他們采用75μm內(nèi)徑的石英毛細(xì)管做為分離室，紫外柱上檢測(cè)的方法，在30kv的分離電壓下分離丹?；被?，柱效達(dá)到40萬個(gè)理論塔板。他們的工作為毛細(xì)管電泳的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。,James W. JorgensonNorth I

3、llinois University化學(xué)系教授,3,第二節(jié) 基本原理,電泳（electrophoresis）是指溶液中帶電粒子（離子）在電場(chǎng)中定向移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳淌度：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下，帶點(diǎn)粒子的電泳速率。 式中 －電泳遷移率（電泳淌度）， 為電泳速率,一、電泳和電泳淌度,電泳淌度與帶電粒子半徑（r）及電荷（q）間的關(guān)系,,電泳淌度的差異構(gòu)成了電泳分離的基礎(chǔ),4,二、電滲和電滲淌度,電滲（elec

4、troosmosis)是毛細(xì)管電泳分離理論中最基本的概念之一。,5,電滲是指在電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管中或固相多孔物質(zhì)內(nèi)，電解質(zhì)溶液朝一個(gè)方向遷移的現(xiàn)象。電滲速率 與固液兩相界面的雙電層Zeta電位 ，緩沖溶液的介電常數(shù) 和黏度 有關(guān)，與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比。單位場(chǎng)強(qiáng)下的電滲速率 ，稱為電滲淌度,,6,三、表觀淌度和遷移時(shí)間,由于電滲流速度大大高于電泳速度，所以，不管正離子、負(fù)離子還是中性分子，均隨電滲流移動(dòng)。,7

5、,1)CE中電滲流的流形,電荷均勻分布，整體移動(dòng),電滲流的流動(dòng)為平流,塞式流動(dòng)（譜帶展寬很?。?； 高效液相色譜中的溶液流動(dòng)為層流,拋物線流型,管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。,,四、柱效和分離度,8,2） CE中電滲流的作用,電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍； 各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為： 陽離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；

6、 陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反； 中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性； 在CE中，控制電滲流非常重要。,9,3)無渦流擴(kuò)散項(xiàng)與傳質(zhì)阻力項(xiàng),在HPCE中，僅存在

7、縱向擴(kuò)散，H=B/u,擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。,影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)管有效長(zhǎng)度與總長(zhǎng)度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：,為兩組分電泳淌度的差值,10,第三節(jié) 毛細(xì)管電泳儀和實(shí)驗(yàn)操作,一、毛細(xì)管電泳儀,11,1.高壓電極槽和進(jìn)樣機(jī)構(gòu) 2.填灌清洗機(jī)構(gòu) 3.毛細(xì)管 4.檢測(cè)器 5.鉑絲電極 6.低壓電極槽 7.恒溫系統(tǒng) 8.數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng),自動(dòng)型毛細(xì)管電泳儀結(jié)構(gòu)示

8、意圖,12,CE的要求：,▲進(jìn)樣機(jī)構(gòu)不存在死體積，能進(jìn)行精確的進(jìn)樣控制?！栌忻?xì)管清洗機(jī)構(gòu)?！邏弘娫粗辽賾?yīng)能輸出200μA×25kV的功率?！鴻z測(cè)器盡量安裝在接地端，優(yōu)先考慮柱上紫外檢測(cè)方式?！?溫控范圍寬，以0 ℃為界，越寬越好，上限不應(yīng)低于50 ℃ ，最好能達(dá)到65～70 ℃ ，至少能在20～40℃內(nèi)恒溫，恒溫精度應(yīng)小于±0.1 ℃ 。,13,高壓電源一般采用（0 ~±30）kV連續(xù)可調(diào)的直

9、流高壓電源，一般要求電壓穩(wěn)定在±0.1%。電極通常由直徑0.5mm ~1mm的鉑絲制成。電極槽通常是帶螺帽的玻璃瓶或塑料瓶（1ml ~ 5ml不等），以便于密封。儀器必須接地，操作過程中必須注意高壓的安全保護(hù)。,一、高壓電源,14,二、毛細(xì)管,1.尺寸 毛細(xì)管尺寸的選擇與分離模式和樣品有關(guān)。自由溶液電泳多選用50或75μm內(nèi)徑的毛細(xì)管，分離的有效長(zhǎng)度?？刂圃?0～100cm之間。如進(jìn)行大顆粒如紅細(xì)胞的分離，則需要內(nèi)徑

10、大于 300μm的毛細(xì)管。CGE或CEC的有效長(zhǎng)度一般控制在20cm左右。 2.涂層 外壁涂一層聚酰亞胺保護(hù)層 ，一般內(nèi)壁不需涂層處理。大分子化合物分離時(shí)，常常需要惰性管壁，以抑制吸附。做CIEF或CGE時(shí)，需要涂層毛細(xì)管以抑制電滲。在分離中，有時(shí)為了加強(qiáng)電滲或改變其方向，也需要涂層毛細(xì)管。,15,3. 清洗毛細(xì)管在使用過程可能被污染，從而影響分析的結(jié)果。為使測(cè)定具有良好的重現(xiàn)性，毛細(xì)管在使用時(shí)應(yīng)經(jīng)常清洗?！展芡ǔＳ?0.

11、l～1mol/L NaOH、水和緩沖液順序沖洗，各洗5~10min，或增加有機(jī)溶劑如甲醇清洗步驟，以除去管中的脂溶性吸附組分。如果懷疑管內(nèi)壁吸附有蛋白質(zhì)或其他有機(jī)分子，可用0.l～1mol/L的HNO3洗 5～10min，然后再按常規(guī)清洗。▲兩次分析之間，可用運(yùn)行緩沖液清洗、平衡。,16,三、進(jìn)樣系統(tǒng),毛細(xì)管通道十分細(xì)小，所需樣品不過數(shù)nl，所以不能采用色譜的進(jìn)樣方式。通過讓毛細(xì)管與樣品溶液直接接觸，然后由重力、電場(chǎng)力或其它動(dòng)力來驅(qū)動(dòng)

12、樣品進(jìn)入管中。進(jìn)樣量可以通過控制驅(qū)動(dòng)力的大小或時(shí)間長(zhǎng)短來控制。進(jìn)樣系統(tǒng)必須包括動(dòng)力控制、計(jì)時(shí)控制、電極槽或毛細(xì)管移位控制等機(jī)構(gòu)。 進(jìn)樣方式：1、壓力法（流體力學(xué)進(jìn)樣） 2、電動(dòng)法,17,1、壓力進(jìn)樣,也稱流動(dòng)進(jìn)樣，它要求毛細(xì)管中的填充介 質(zhì)具有流動(dòng)性。當(dāng)毛細(xì)管兩端置于不同的 壓力環(huán)境中時(shí)，管中溶液即能流動(dòng)，將樣 品帶入?？捎萌N方法產(chǎn)生進(jìn)樣動(dòng)力：正壓、負(fù)壓

13、 （管尾抽吸）、重力（虹吸）。采用壓縮空氣（氣體鋼瓶）可實(shí)現(xiàn)正壓 進(jìn)樣，并可與毛細(xì)管清洗系統(tǒng)共用，多 為商品儀器采用。優(yōu)點(diǎn)：壓力進(jìn)樣沒有偏向問題，缺點(diǎn)：選擇性差，樣品及其背景同時(shí)被引入 管中，對(duì)后續(xù)分離可能產(chǎn)生影響。,18,電動(dòng)進(jìn)樣,當(dāng)把毛細(xì)管的進(jìn)樣端插入樣品溶液并加上電場(chǎng)時(shí)，組分就會(huì)因電遷移和電滲作用而進(jìn)入管內(nèi)。電動(dòng)進(jìn)樣的控制參數(shù)是電場(chǎng)強(qiáng)度E和進(jìn)樣時(shí)間t。電場(chǎng)強(qiáng)度E取值多在1～60kv/60

14、cm 之間；進(jìn)樣時(shí)間通常在1～10s 之間，有時(shí)可達(dá)1min或更大。優(yōu)點(diǎn)：電動(dòng)進(jìn)樣對(duì)毛細(xì)管內(nèi)的填充介質(zhì)沒有特殊限制，屬普適性方法，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。缺點(diǎn)：電動(dòng)進(jìn)樣對(duì)離子組分存在偏向，降低分析的準(zhǔn)確性和可靠性。,19,四. 檢測(cè)器,在毛細(xì)管電泳中，毛細(xì)管柱內(nèi)徑?。ㄍǔ?0μm或75μm)，區(qū)帶體積小，僅為nl級(jí)，區(qū)帶遷移速度快，這就對(duì)檢測(cè)器提出了很高的要求。毛細(xì)管電泳要求檢測(cè)方法必須具有很高的靈敏度和很快的響應(yīng)速度，且不能引起區(qū)帶擴(kuò)

15、張。常用柱上檢測(cè)法,20,紫外檢測(cè),由于紫外檢測(cè)器價(jià)格便宜，通用性好，石英毛細(xì)管柱有良好的紫外透過性，易于實(shí)現(xiàn)柱上檢測(cè)；再加上大多數(shù)有機(jī)化合物包括蛋白質(zhì)等生物大分子都含有紫外發(fā)色團(tuán)，所以它是目前應(yīng)用最廣的檢測(cè)器。但是，由于受毛細(xì)管內(nèi)徑的限制，檢測(cè)靈敏度較低。 固定波長(zhǎng)檢測(cè)器 可變波長(zhǎng)檢測(cè)器 二極管陣列檢測(cè)器,,21,激

16、光誘導(dǎo)熒光（LIF）,采用激光（強(qiáng)度高，準(zhǔn)直性好，可聚焦成比毛細(xì)管更細(xì)的光束射入毛細(xì)管內(nèi)部），激發(fā)出強(qiáng)的熒光。LIF能減小因毛細(xì)管壁的散射所引起的背景噪聲。,1.激光器 2.高壓電源 3.毛細(xì)管 4.單色器 5.光電倍增管 6.記錄儀 8.激發(fā)光光纖 9.熒光收集光纖,22,其他檢測(cè)器,電化學(xué)檢測(cè)器化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器,23,第四節(jié) 定性和定量分析方法,一、定性分析方法,以相對(duì)遷移時(shí)間與對(duì)照品對(duì)

17、比定性；與質(zhì)譜聯(lián)用定性。,二、定量分析方法,1、內(nèi)標(biāo)法2、疊加對(duì)比法,24,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳的主要分離模式,毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）膠束電動(dòng)色譜（micellar electrokinetic chromatography, MEKC)毛細(xì)管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis, CGE)毛細(xì)管等速電泳（capillary isot

18、achophoresis, CITP) 毛細(xì)管等電聚焦（capillary isoelectric focus, CIF)毛細(xì)管電色譜（capillary electrochromatography, CEC),25,一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（CZE）,毛細(xì)管電泳最基本的分離模式。背景電解質(zhì)是緩沖液，分離是基于樣品中各個(gè)組分間質(zhì)荷比的差異。有時(shí)需在緩沖液中加入一定的添加劑，用以提高分離選擇性，改變電滲流的大小、方向或抑制毛細(xì)管壁的吸附等

19、。在CZE中，影響分離的操作條件為： ◆分離電壓 ◆背景電解質(zhì)種類、濃度和pH ◆添加劑種類和濃度,26,分離效率與電壓間存在極大值。極大電壓通常也是最佳工作電壓。在實(shí)際分離中，如果所用的毛細(xì)管很細(xì)或緩沖液的電導(dǎo)很低，極大電壓可能會(huì)超出儀器范圍，此時(shí)沒有最佳電壓，可選擇儀器允許的最大輸出電壓。當(dāng)毛細(xì)管較粗或緩沖液電導(dǎo)較高時(shí)，極大電壓可能很小，若此時(shí)分離度很高，也可選擇大于極大值的電壓進(jìn)行分離。,1

20、. 分離電壓,27,毛細(xì)管的溫度不僅影響分離的重視性，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮熱效應(yīng)、分析重現(xiàn)性、分離效率和分離介質(zhì)對(duì)溫度的限制等因素。溫度的確定也應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)，多數(shù)情況下，在20～30℃之間進(jìn)行電泳，能獲得良好的分離效果?？筛鶕?jù)初步分離結(jié)果調(diào)整溫度。不少糖類樣品需要高于室溫的分離環(huán)境，一些樣品如蛋白等則可能需要低于室溫的分離條件。,2.分離溫度,28,對(duì)背景電解質(zhì)的要求：①在所選擇的pH范圍內(nèi)有足夠大的緩沖容量。②在檢測(cè)

21、波長(zhǎng)處的吸收低。③自身的淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流的產(chǎn)生。④應(yīng)使被測(cè)組分帶合適的電荷量，以實(shí)現(xiàn)有效進(jìn)樣和有合適的電泳淌度。⑤盡可能采用酸性緩沖溶液，在低pH下，吸附和電滲流值都很小。⑥與毛細(xì)管種類匹配，涂層毛細(xì)管只能在一定pH范圍內(nèi)使用。,3. 背景電解質(zhì),29,在CZE中，常用于毛細(xì)管電泳的緩沖溶液有硼砂、磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和醋酸鹽等。 緩沖體系的pH值要求與樣品的性質(zhì)有關(guān)，通常酸性組分的分離

22、選擇在堿性條件下進(jìn)行，而堿性組分則選擇酸性介質(zhì)分離，蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等兩性物質(zhì)，可選酸性(pH2)也可選堿性(pH>9)分離介質(zhì)。糖類樣品通常在pH9~11之間能獲得最佳分離，羧酸或其它樣品多在pH5~9之間選擇分離條件。,30,二、膠束電動(dòng)色譜法（MEKC）,在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑（如SDS），當(dāng)表面活性劑濃度超過其臨界膠束濃度時(shí)，則形成膠束，膠束具有疏水內(nèi)核, 外層帶負(fù)電荷。溶質(zhì)分子則在極性緩沖液與膠束中心的非極

23、性相（假固定相）之間有一定的分配。 中性分子因其本身疏水性不同，在兩相中分配存在差異。在電滲流作用下，膠束攜帶溶質(zhì)一起前行，疏水性強(qiáng)的溶質(zhì)和膠束結(jié)合得較牢，流出慢。溶質(zhì)分子由于表觀淌度及其在兩相中的分配系數(shù)的差異是MEKC分離的基礎(chǔ)。,31,常用的陰離子表面活性劑有十二烷基硫酸鈉（SDS）、N-月桂酰-N-甲基牛磺酸鈉（LMT）、牛磺脫氧膽酸鈉（STDC）等。陽離子表面活性劑最常用的是季銨鹽，如十二烷基三甲基溴

24、化銨（DTAB）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等。非離子型表面活性劑有3-[3-(氯化酰胺基丙基)二甲基胺基]-1-丙基磺酸酯（CHAPS）等。另外，還有手性表面活性劑，如膽酸、毛地黃皂苷、十二烷基-N-L-纈氨酸鈉等。,32,表面活性劑選擇時(shí)應(yīng)考慮以下因素：（1）經(jīng)濟(jì)易得（2）水溶性好（3）紫外吸收背景越低越好（4）不與樣品發(fā)生破壞性作用（5）所形成的膠束足夠穩(wěn)定,33,三、環(huán)糊精修飾毛細(xì)管電泳法,將適量環(huán)糊精及其衍

25、生物加入緩沖溶液作為添加劑而進(jìn)行的毛細(xì)管電泳。,,分離手型異構(gòu) 體常用的方法。,環(huán)糊精，吡喃葡萄糖單元構(gòu)成錐筒形結(jié)構(gòu)。待分離組分的分子大小，相對(duì)極性，與CD環(huán)鑲嵌關(guān)系決定手性分子的表觀淌度。,34,四、毛細(xì)管電色譜（CEC）,以微填充柱作為分離柱，以電滲流（電滲+液壓）驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相完成色譜分離過程。,基于組分的分配系數(shù)和電泳淌度及的差異實(shí)現(xiàn)組分的分離。,35,CEC中，固定相的選擇主要依據(jù)HPLC的理論和經(jīng)驗(yàn)，常用C18或C8 。 根

26、據(jù)固定相的特性（正相、反相等），緩沖液可以是水溶液或有機(jī)溶液。常用乙腈－水或甲醇－水等為流動(dòng)相。,五、毛細(xì)管凝膠電泳,分離機(jī)理基于電泳與凝膠色譜的組合,36,毛細(xì)管分離條件選擇流程,1.盡可能多地了解樣品的類型、來源、組成及其性質(zhì)。2.根據(jù)樣品性質(zhì)、來源選擇分離模式，若無樣品信息可先選CZE。3.根據(jù)樣品性質(zhì)確定檢測(cè)方法。4.確定pH、緩沖試劑濃度。5.優(yōu)化其它操作參數(shù)，如毛細(xì)管尺寸、分離電壓、溫度等。6.確定是否需要使用添加