重組人血管生成素復(fù)性純化及腸道抗菌作用研究.pdf

1、人血管生成素(Angiogenin，ANG)是123個(gè)氨基酸的單鏈堿性蛋白，與RNaseA有33％同一性，是核糖核酸酶超家族中獨(dú)具促血管生成活性的一員。雖然ANG最初從腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清分離到，但發(fā)現(xiàn)它也是正常血清中的成分，存在于多種組織和細(xì)胞中。研究表明ANG與損傷組織的修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移及先天性免疫等均有密切的關(guān)系。該文通過(guò)對(duì)重組大腸桿菌表達(dá)的rhANG包涵體復(fù)性條件的優(yōu)化，以提高rhANG復(fù)性效率，為rhANG的放大生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。此外，

2、檢測(cè)ANG在人小腸組織細(xì)胞中的定位及抑菌活性，為揭示ANG在腸道粘膜免疫防御中作用機(jī)制的研究提供思路。 采用超聲波破碎細(xì)胞，低速離心收集包涵體，TritonX-100洗滌包涵體。分離的包涵體溶解于7mol/L鹽酸胍、10mmol/LDTT。變性rhANG稀釋到合適的緩沖液中使之重新折疊。分析GSH/GSSG比率、pH、蛋白濃度、低濃度變性劑、添加精氨酸、稀釋方式對(duì)rhANG復(fù)性的影響。結(jié)果表明在0.1mol/LTris-HClp

3、H7～8，還原型、氧化型谷胱甘肽比率1～5，GSH濃度為0.5～1.5mmol/L，鹽酸胍為0.2～0.5mol/L，DTT為0.5mmol/L，起始蛋白濃度0.2mg/ml時(shí)，rhANG蛋白復(fù)性率為60％，較優(yōu)化前提高35％。0.5mol/LL-精氨酸有助復(fù)性，減少聚集體產(chǎn)生。脈沖稀釋復(fù)性可提高單位體積復(fù)性蛋白量。經(jīng)陽(yáng)離子交換層析純化獲得的rhANG具有核糖核酸酶活性和促血管生成活性。 ANG免疫組化結(jié)果顯示人小腸腸隱窩基底部