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文檔簡介
1、本研究成功建立了雞胚原始生殖細胞(Primordial Germ Cells,PGCs)的體外培養(yǎng)體系,并對其生物學特性進行鑒定。探討了雞胚PGCs減數(shù)分裂過程及精子發(fā)生相關基因表達量的變化。分離培養(yǎng)8w綿羊的羊水干細胞(Amniotic Fluid Stem Cells,AFSCs)并鑒定其生物學特性,為AFSCs應用于組織工程學及細胞移植治療提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn):
1使用在孵化箱中孵化5.5 d的雞胚進行PGCs的分離。
2、在體視顯微鏡下小心剝離出雞胚兩側(cè)性腺,剪碎后使用0.125%胰蛋白酶+0.02% EDTA吹打消化,然后接種在培養(yǎng)皿中使用H-DMEM培養(yǎng),并添加10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,F(xiàn)BS),1 mM丙酮酸鈉,1% GlutaMAX,5 ng/mLSCF,5 ng/mL LIF,10 ng/mL bFGF,10 ng/mL IGF等因子促進PGCs的增殖及抑制分化。培養(yǎng)24 h后,可在顯微鏡下觀察到PGCs克隆團的出現(xiàn)
3、,此時的飼養(yǎng)層為雞胚性腺基質(zhì)細胞。48 h后顯微鏡下觀察到PGCs克隆團數(shù)量增多,體積變大,呈典型的鋪路石樣。繼代培養(yǎng)時使用雞胚成纖維細胞(Chicken Embryo Fibroblast,CEF)飼養(yǎng)層。無論是CEF飼養(yǎng)層還是雞胚性腺基質(zhì)細胞都能夠PGCs保持穩(wěn)定的未分化狀態(tài)。在本研究中PGCs可在體外連續(xù)培養(yǎng)2個月,經(jīng)AKP和PAS染色鑒定為陽性;形態(tài)上PGCs較一般細胞大,折光性強;RT-PCR、免疫細胞化學鑒定(immunoc
4、ytochemistry)和流式細胞分析(Flow Cytometry, FCM)結(jié)果顯示, PGCs對生殖細胞及胚胎干細胞(Embryonic Stem Cell,ESCs)的特異性標志物呈現(xiàn)陽性反應。
2雞胚PGCs在骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)、激活素A(Activin A)和維甲酸(Retinoic Acid,RA)的作用下可啟動減數(shù)分裂過程,進而在(Bovine
5、Pituitary Extract,BPE)、(Follicle-stimulating hormone,F(xiàn)SH)和睪酮(Testosterone,T)的促進下誘導生成精子。從qPCR結(jié)果可證明這些激素促進了PGCs向精子的分化。
3在無菌狀態(tài)下使用注射器抽取8w綿羊胚胎羊水10 mL,并以1500 rpm的速度離心15 min使細胞富集于離心管底部,最終將細胞接種至12孔板中進行培養(yǎng),培養(yǎng)基選擇DMEM/F12添加10 ng
6、/mL bFGF。羊水中含有多種細胞類型,不同類型的細胞形態(tài)也不盡相同。傳代時選擇長梭形細胞占多數(shù)的那一孔進行傳代操作。消化條件為0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA于37.5℃培養(yǎng)箱中消化1 min。在經(jīng)過數(shù)次傳代細胞純度較高時,對AFSCs的生物學特性進行鑒定。RT-PCR及免疫細胞化學檢測結(jié)果顯示AFSCs既表達間充質(zhì)干細胞表面標記物又表達胚胎干細胞特異性標志物。生長曲線實驗結(jié)果顯示AFSCs的增長呈現(xiàn)典型的S型。核型分析結(jié)果
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