冰島硫化葉菌DExD-H-box家族解旋酶SiRe_0681與SiRe_1605的功能分析.pdf

1、DExD/H-box蛋白指的是一類具有NTP酶活性的，隸屬超級(jí)族2的DNA或RNA解旋酶，廣泛存在于全部的真核生物細(xì)胞和大多數(shù)的細(xì)菌與古菌中，并且在這些物種中都具有很高的保守性。DExD/H-box解旋酶普遍具有9個(gè)保守的基序，基序Ⅱ中存在核心的保守氨基酸序列D-E-A-D(asp-glu-ala-asp)，這個(gè)基序被認(rèn)為是ATP的結(jié)合位點(diǎn)，ATP水解為解旋酶的解旋活性提供能量，也根據(jù)這個(gè)基序?qū)φ麄€(gè)蛋白家族進(jìn)行命名。DExD/H-box

2、解旋酶參與許多細(xì)胞進(jìn)程，在核酸代謝過程中起著重要作用，比如參與雙鏈解旋、mRNA前體加工、轉(zhuǎn)錄、翻譯、以及mRNA降解、基因損傷修復(fù)、核糖體生物合成、核糖核蛋白(RNP)復(fù)合體重排以及核質(zhì)運(yùn)輸?shù)取?br>　　冰島硫化葉菌(Sulfolobus islandicus)是一種在北半球廣泛分布的極端嗜酸嗜熱古菌。DExD/H-box解旋酶的存在，對(duì)該古菌在極端環(huán)境下的生存起著重要作用，但是對(duì)DExD/H-box解旋酶的研究仍然很有限。實(shí)驗(yàn)室前

3、期研究中，得到了冰島硫化葉菌中兩個(gè)DExD/H-box解旋酶SiRe_0681與SiRe_1605的基因敲除型菌株，并分析了體內(nèi)功能，但是敲除菌株的表型分析不夠全面，體外生化實(shí)驗(yàn)也尚未進(jìn)行。本課題嘗試對(duì)冰島硫化葉菌中的兩個(gè)DExD/H-box解旋酶SiRe_0681與SiRe1605進(jìn)行進(jìn)一步研究。在古菌體內(nèi)過表達(dá)蛋白，測(cè)量生長(zhǎng)曲線，并檢測(cè)敲除菌株在低溫環(huán)境下的生長(zhǎng)速率，探索其體內(nèi)功能。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析敲除菌株在有或無MMS損傷劑處理

4、下的轉(zhuǎn)錄水平變化，分析SiRe_0681與SiRe_1605在細(xì)胞內(nèi)參與的途徑與發(fā)揮的功能。并且在大腸桿菌中表達(dá)純化蛋白，初步檢測(cè)解旋酶活性。
　　將SiRe_0681與SiRe_1605分別在古菌體內(nèi)過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對(duì)菌株的生長(zhǎng)沒有明顯的影響。但是在60℃的相對(duì)低溫下，ΔSiRe_0681與ΔSiRe_1605兩個(gè)敲除型菌株的生長(zhǎng)速度都比野生型慢很多，說明DExD/H-box解旋酶對(duì)冷脅迫下S.islandicus的生存起著重要作用

5、。之前的研究中發(fā)現(xiàn)，ΔSiRe_0681在最適溫度75℃下的生長(zhǎng)速度比野生型REY15A要快，流式細(xì)胞分析表明敲除SiRe_0681可能跳過了一些G1/S期的核酸加工修飾過程，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)程加快。但是當(dāng)在相對(duì)低溫條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)速度卻減慢了很多，說明這些SiRe_0681所調(diào)節(jié)的核酸加工修飾可能對(duì)細(xì)胞應(yīng)對(duì)低溫脅迫有很大幫助，有利于嗜熱菌在更廣泛的溫度中生存。SiRe_1605的缺失同樣導(dǎo)致了低溫下細(xì)胞生長(zhǎng)速度的減慢，而且敲除SiRe_16

6、05會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在MMS損傷劑處理下更容易發(fā)生聚集。說明SiRe_1605可能參與基因修復(fù)，對(duì)于細(xì)胞遭受到冷脅迫或者損傷時(shí)，都會(huì)發(fā)揮重要的作用。
　　轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，MMS處理后ΔSiRe_0681中與細(xì)胞分裂相關(guān)的基因全部出現(xiàn)上調(diào)。反向旋轉(zhuǎn)酶(reverse gyrase)對(duì)極端嗜熱菌在高溫下生存非常重要，反向旋轉(zhuǎn)酶在ΔSiRe_0681中顯著上調(diào)，在ΔSiRe_1605中卻表現(xiàn)出顯著下調(diào)，說明其對(duì)二者在MMS損傷劑處理下分別

7、表現(xiàn)出的生長(zhǎng)加快與生長(zhǎng)減慢現(xiàn)象有一定的影響。MMS處理后ΔSiRe_1605中與基因修復(fù)、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因都發(fā)生了下調(diào)，說明SiRe_1605參與細(xì)胞的損傷修復(fù)途徑，缺失后導(dǎo)致細(xì)胞面對(duì)損傷壓力加大，不得不減慢生長(zhǎng)速度來爭(zhēng)取時(shí)間修復(fù)。根據(jù)總體轉(zhuǎn)錄水平的上下調(diào)以及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，敲除SiRe_1605對(duì)細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)水平以及代謝通路的影響比敲除SiRe_0681要大，說明SiRe_1605還可能參與許多細(xì)胞中的代謝通路以及

8、表達(dá)調(diào)控過程。
　　在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)，由于兩個(gè)解旋酶SiRe_0681與SiRe_1605的基因敲除，導(dǎo)致一段連續(xù)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄水平為0，這種特殊的現(xiàn)象可能與DExD/H-box解旋酶對(duì)基因沉默機(jī)制的調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　在大腸桿菌中表達(dá)SiRe_0681，并使用熱處理與鎳柱親和層析的方法進(jìn)行了純化。SiRe_1605蛋白表達(dá)時(shí)容易形成沉淀，而且可能會(huì)從序列中間起始翻譯同時(shí)表達(dá)多個(gè)蛋白，難以純化。嘗試改進(jìn)表達(dá)純化條件，更換載體，