稻瘟病菌DExD-H-box基因家族序列分析及功能初探.pdf

1、DExD/H-box家族是一類RNA解旋酶超家族，存在于所有真核生物中。病原真菌中DExD/H-box蛋白研究較少，其中被證實在致病過程中起作用的僅有1例，為人類病原真菌新型隱球菌（Cryptococcus neof ormans）中的Vad1。而植物病原真菌中，尚未見有關DExD/H-box蛋白的報道。稻瘟病菌是植物病原真菌的模式物種，探索DExD/H-box家族基因在稻瘟病菌致病過程中的作用對植物病原真菌致病機理的研究意義重大。本文

2、通過稻瘟病菌基因組檢索，獲得51個DExD/H-box家族基因并進行了生物信息學分析;在此基礎上，對其中MoDHX35、MoDHH1兩個基因進行了功能分析，從而探索該家族基因與稻瘟病菌致病性的相互關系。
　　利用同源檢索在稻瘟病菌基因組中發(fā)現51個DExD/H-box家族基因。對這些基因的序列連配及同源分析表明該家族基因較為保守，進化差異較小，可能由同一祖先進化而來?；蚪Y構分析表明該家族基因大多含有1～2個內含子，多為0型及2型

3、內含子，易于轉錄翻譯。連配及MEME分析發(fā)現多數序列都含有8～9個保守基序，這些基序可能通過折疊與組裝形成解旋酶的核心區(qū)域。利用Real-Time PCR在稻瘟病菌不同發(fā)育階段檢測這些基因的表達變化，篩選獲得了在不同階段特異表達的基因，為稻瘟病菌中該家族的后續(xù)研究提供了重要信息。
　　MoDHX35是人類基因DHX35在稻瘟病菌中的同源基因，具有DEAH-box亞家族蛋白的8個保守基序。通過同源置換獲得了該基因敲除突變體，并進行互

4、補。表型分析結果標明，突變體在含有阿霉素的CM培養(yǎng)基上生長速率減慢，互補可以恢復這種缺陷，說明MoDHX35基因的敲除可能影響了RNA代謝過程。與野生型相比，MoDHX35突變體對寄主的致病性下降。侵染過程觀察發(fā)現，突變體附著胞的形成能力顯著降低，推斷這是突變體致病能力下降的主要原因。
　　Vad1影響新型隱球菌致病能力，在釀酒酵母中，其同源基因為DHH1，屬于DExD/H-box家族。我們對其在稻瘟病菌中的同源基因MoDHH1進

5、行了研究。MoDHH1基因能夠互補酵母△DHH1突變體對阿霉素和MMS的抗性，表明了MoDHH1與酵母DHH1的功能同源性。Real-Time PCR表明MoDHH1在孢子萌發(fā)過程中的表達呈先上升后下降的趨勢，誘導10h～12h出現表達量高峰，與稻瘟病菌附著胞形成及侵染的關鍵時期相一致。通過同源替換獲得了7個單臂插入的轉化子。通過基因表達量變化結合藥物抗性篩選獲得到對阿霉素抗性降低、基因表達量降低的轉化子MoDHH1-32、MoDHH1

6、-59。表型分析發(fā)現，MoDHH1-32、MoDHH1-59產孢能力降低、萌發(fā)減慢、附著胞形成減慢或形成率降低、致病能力有所下降，其中MoDHH1-32變化尤為明顯;另外，RNA代謝阻抑藥物抗性檢測及溫度敏感檢測發(fā)現二者對阿霉素抗性減弱、對33℃高溫敏感，對放線菌酮、細胞分裂抑制劑、多菌靈、卡式白的抗性略有減弱。酵母中RNA代謝缺陷可引起類似表型。因此推測這兩個轉化子可能是由于MoDHH1基因功能受影響而導致RNA代謝缺陷，從而產生了一