稻瘟病菌DExD-H-box基因家族序列分析及功能初探.pdf

1、DExD/H-box家族是一類RNA解旋酶超家族，存在于所有真核生物中。病原真菌中DExD/H-box蛋白研究較少，其中被證實(shí)在致病過(guò)程中起作用的僅有1例，為人類病原真菌新型隱球菌（Cryptococcus neof ormans）中的Vad1。而植物病原真菌中，尚未見(jiàn)有關(guān)DExD/H-box蛋白的報(bào)道。稻瘟病菌是植物病原真菌的模式物種，探索DExD/H-box家族基因在稻瘟病菌致病過(guò)程中的作用對(duì)植物病原真菌致病機(jī)理的研究意義重大。本文

2、通過(guò)稻瘟病菌基因組檢索，獲得51個(gè)DExD/H-box家族基因并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;在此基礎(chǔ)上，對(duì)其中MoDHX35、MoDHH1兩個(gè)基因進(jìn)行了功能分析，從而探索該家族基因與稻瘟病菌致病性的相互關(guān)系。
　　利用同源檢索在稻瘟病菌基因組中發(fā)現(xiàn)51個(gè)DExD/H-box家族基因。對(duì)這些基因的序列連配及同源分析表明該家族基因較為保守，進(jìn)化差異較小，可能由同一祖先進(jìn)化而來(lái)?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明該家族基因大多含有1～2個(gè)內(nèi)含子，多為0型及2型

3、內(nèi)含子，易于轉(zhuǎn)錄翻譯。連配及MEME分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)序列都含有8～9個(gè)保守基序，這些基序可能通過(guò)折疊與組裝形成解旋酶的核心區(qū)域。利用Real-Time PCR在稻瘟病菌不同發(fā)育階段檢測(cè)這些基因的表達(dá)變化，篩選獲得了在不同階段特異表達(dá)的基因，為稻瘟病菌中該家族的后續(xù)研究提供了重要信息。
　　MoDHX35是人類基因DHX35在稻瘟病菌中的同源基因，具有DEAH-box亞家族蛋白的8個(gè)保守基序。通過(guò)同源置換獲得了該基因敲除突變體，并進(jìn)行互

4、補(bǔ)。表型分析結(jié)果標(biāo)明，突變體在含有阿霉素的CM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率減慢，互補(bǔ)可以恢復(fù)這種缺陷，說(shuō)明MoDHX35基因的敲除可能影響了RNA代謝過(guò)程。與野生型相比，MoDHX35突變體對(duì)寄主的致病性下降。侵染過(guò)程觀察發(fā)現(xiàn)，突變體附著胞的形成能力顯著降低，推斷這是突變體致病能力下降的主要原因。
　　Vad1影響新型隱球菌致病能力，在釀酒酵母中，其同源基因?yàn)镈HH1，屬于DExD/H-box家族。我們對(duì)其在稻瘟病菌中的同源基因MoDHH1進(jìn)

5、行了研究。MoDHH1基因能夠互補(bǔ)酵母△DHH1突變體對(duì)阿霉素和MMS的抗性，表明了MoDHH1與酵母DHH1的功能同源性。Real-Time PCR表明MoDHH1在孢子萌發(fā)過(guò)程中的表達(dá)呈先上升后下降的趨勢(shì)，誘導(dǎo)10h～12h出現(xiàn)表達(dá)量高峰，與稻瘟病菌附著胞形成及侵染的關(guān)鍵時(shí)期相一致。通過(guò)同源替換獲得了7個(gè)單臂插入的轉(zhuǎn)化子。通過(guò)基因表達(dá)量變化結(jié)合藥物抗性篩選獲得到對(duì)阿霉素抗性降低、基因表達(dá)量降低的轉(zhuǎn)化子MoDHH1-32、MoDHH1

6、-59。表型分析發(fā)現(xiàn)，MoDHH1-32、MoDHH1-59產(chǎn)孢能力降低、萌發(fā)減慢、附著胞形成減慢或形成率降低、致病能力有所下降，其中MoDHH1-32變化尤為明顯;另外，RNA代謝阻抑藥物抗性檢測(cè)及溫度敏感檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二者對(duì)阿霉素抗性減弱、對(duì)33℃高溫敏感，對(duì)放線菌酮、細(xì)胞分裂抑制劑、多菌靈、卡式白的抗性略有減弱。酵母中RNA代謝缺陷可引起類似表型。因此推測(cè)這兩個(gè)轉(zhuǎn)化子可能是由于MoDHH1基因功能受影響而導(dǎo)致RNA代謝缺陷，從而產(chǎn)生了一