CDK2在畢赤酵母中的異源表達(dá)及初步晶體學(xué)研究.pdf

1、蛋白激酶又稱(chēng)蛋白質(zhì)磷酸化酶。作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要的中間分子,蛋白激酶在生物體內(nèi)發(fā)揮了重要的作用。細(xì)胞在受到外界信號(hào)刺激后,會(huì)激活蛋白激酶的活性,并使下游蛋白質(zhì)磷酸化,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。CDK2作為一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(Cyclin-Dependent Kinasas,CDKs),在與特定的細(xì)胞周期蛋白Cyclins結(jié)合后被激活,然后使下游一些重要周期蛋白磷酸化,從而調(diào)控著細(xì)胞周期的運(yùn)行。臨床研究發(fā)現(xiàn)CDK2的過(guò)量表達(dá)會(huì)

2、導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
　　本文通過(guò)原核和真核兩種表達(dá)體系即大腸桿菌和畢赤酵母對(duì)cdk2基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)兩種體系中表達(dá)的目的蛋白分離純化并進(jìn)行定性定量的檢測(cè)分析。通過(guò)比較,選擇表達(dá)量高及表達(dá)蛋白穩(wěn)定性更好的宿主進(jìn)行大量表達(dá)和純化,將純化后的蛋白用于結(jié)晶。
　　主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.以質(zhì)粒cdk2為模板,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出cdk2的全長(zhǎng)cDNA,構(gòu)建大腸桿菌原核表達(dá)載體pET28a(+)-GST-TEV

3、-cdk2和畢赤酵母真核表達(dá)載體pPIC3.5K-cdk2及pPIC9K-cdk2。前兩種表達(dá)載體是胞內(nèi)表達(dá)載體,后一種是分泌性表達(dá)載體。將pET28a(+)-GST-TEV-cdk2轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)Rosetta中,然后用異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。pPIC3.5K-cdk2和pPIC9K-cdk2分別用限制性酶線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

4、　　2.用Ni-NTAResin和凝膠層析純化目的蛋白,表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE和Western-Blot分析鑒定。結(jié)果表明重組蛋白在大腸桿菌和畢赤酵母中均獲得正確可溶性表達(dá),且大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)量是4.68mg/L,畢赤酵母中表達(dá)產(chǎn)量是6.04mg/L。對(duì)胞外表達(dá),則沒(méi)有檢測(cè)到目標(biāo)產(chǎn)物。利用圓二色譜(Circular Dichroism,CD)對(duì)在兩種表達(dá)體系中表達(dá)純化的目的蛋白進(jìn)行折疊構(gòu)象分析,結(jié)果表明畢赤酵母中表達(dá)的目的蛋白的有效