CDK2在畢赤酵母中的異源表達及初步晶體學(xué)研究.pdf

1、蛋白激酶又稱蛋白質(zhì)磷酸化酶。作為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要的中間分子,蛋白激酶在生物體內(nèi)發(fā)揮了重要的作用。細胞在受到外界信號刺激后,會激活蛋白激酶的活性,并使下游蛋白質(zhì)磷酸化,從而實現(xiàn)細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。CDK2作為一種細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-Dependent Kinasas,CDKs),在與特定的細胞周期蛋白Cyclins結(jié)合后被激活,然后使下游一些重要周期蛋白磷酸化,從而調(diào)控著細胞周期的運行。臨床研究發(fā)現(xiàn)CDK2的過量表達會

2、導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
　　本文通過原核和真核兩種表達體系即大腸桿菌和畢赤酵母對cdk2基因進行誘導(dǎo)表達,對兩種體系中表達的目的蛋白分離純化并進行定性定量的檢測分析。通過比較,選擇表達量高及表達蛋白穩(wěn)定性更好的宿主進行大量表達和純化,將純化后的蛋白用于結(jié)晶。
　　主要的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.以質(zhì)粒cdk2為模板,利用聚合酶鏈式反應(yīng)擴增出cdk2的全長cDNA,構(gòu)建大腸桿菌原核表達載體pET28a(+)-GST-TEV

3、-cdk2和畢赤酵母真核表達載體pPIC3.5K-cdk2及pPIC9K-cdk2。前兩種表達載體是胞內(nèi)表達載體,后一種是分泌性表達載體。將pET28a(+)-GST-TEV-cdk2轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)Rosetta中,然后用異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達。pPIC3.5K-cdk2和pPIC9K-cdk2分別用限制性酶線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,篩選陽性克隆進行甲醇誘導(dǎo)蛋白表達。

4、　　2.用Ni-NTAResin和凝膠層析純化目的蛋白,表達產(chǎn)物用SDS-PAGE和Western-Blot分析鑒定。結(jié)果表明重組蛋白在大腸桿菌和畢赤酵母中均獲得正確可溶性表達,且大腸桿菌中表達產(chǎn)量是4.68mg/L,畢赤酵母中表達產(chǎn)量是6.04mg/L。對胞外表達,則沒有檢測到目標產(chǎn)物。利用圓二色譜(Circular Dichroism,CD)對在兩種表達體系中表達純化的目的蛋白進行折疊構(gòu)象分析,結(jié)果表明畢赤酵母中表達的目的蛋白的有效