20897.畢赤酵母異源表達(dá)靈芝漆酶及酶學(xué)特性與功能的研究

1、，孫靜：畢赤酵母異源表達(dá)靈芝漆酶及酶學(xué)特性與功能的研究畢赤酵母異源表達(dá)靈芝漆酶及酶學(xué)特性與功能的研究研究生：孫靜導(dǎo)師：陳建民教授姚泉洪研究員(揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州，225009；上海農(nóng)科院，上海，201106)摘要漆酶(Laccase)是一種含多個(gè)銅原子的多酚氧化酶，目前已經(jīng)有報(bào)道多種來(lái)源的漆酶能夠在體外催化降解多種污染物，包括酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、羥酸及其衍生物、甾體激素和生物色素、金屬有機(jī)化合物及其他非酚類底物等。構(gòu)建靈芝漆

2、酶表達(dá)質(zhì)粒，在畢赤酵母中異源表達(dá)并得到純化的漆酶，從而進(jìn)一步研究靈芝漆酶的酶學(xué)特性及對(duì)幾種染料的降解情況，可以為靈芝漆酶高效工程菌株的構(gòu)建、靈芝漆酶工業(yè)化生產(chǎn)提供平臺(tái)。本研究根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的靈芝菌株70719的漆酶基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PTDS方法合成了靈芝漆酶GILCC基因，并且進(jìn)行了畢赤酵母的偏愛(ài)密碼子改造。為了進(jìn)一步研究G1LCC蛋白的酶學(xué)特性與功能，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法將帶有目的基因GILCC的重組質(zhì)粒表、達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，

3、添加了AOXI啟動(dòng)子使其在畢赤酵母中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)。對(duì)表達(dá)的靈芝漆酶使用6xHis與鎳柱結(jié)合的方法進(jìn)行純化與酶蛋白定量，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行SDSPAGE電泳，得到靈芝漆酶的分子量在58KD左右。對(duì)靈芝漆酶酶學(xué)性質(zhì)分析，得到了其對(duì)于特異性底物ABTS的最適反應(yīng)溫度與pH值分別為55“C和26，在25。C時(shí)溫度穩(wěn)定性最高，對(duì)酸性范圍內(nèi)的pH具有良好的穩(wěn)定性，對(duì)金屬離子Fe2和Fe3高度敏感產(chǎn)生抑制作用，K、Na、Ca2、M92、Cu2可以提

4、高酶的活性。G1LCC對(duì)底物ABTS的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)‰值為09665mM，V，懈為3024ItMmgJm甜1，而對(duì)愈瘡木酚的‰值為1112mM，VⅡ墩為8213lxMmg。rain～。針對(duì)漆酶類對(duì)染料的獨(dú)特降解作用，對(duì)靈芝漆酶作用于不同染料(偶氮類、三苯甲烷類)降解進(jìn)行了研究。對(duì)甲基橙、孔雀石綠、結(jié)晶紫、亮綠4種染料進(jìn)行了脫色實(shí)驗(yàn)，確定了最適脫色條件并探討了反應(yīng)時(shí)間、金屬離子對(duì)染料孫靜：畢赤酵母異源表達(dá)靈芝漆酶及酶學(xué)特性與功能的研究S

5、ecretoryexpressionandcharacterizationofasolublelaccasefromtheGanodermalucidumstrain70719inPichinpastorisPostgraduate：JingSunAdivisor：ProfJianminChenProfQuanhongYao(YangzhouUniversity，YangzhouJiangsu，225009；ShanghaiAcadem

6、yofAgriculturalScience，Shanghai，201106)AbstractLaccasesaremulticoppercontainingoxidasesthatcatalyzetheoxidationofmanysubstrates，suchasphenolsandpamphyl，arylamine，hydroxyacidsteroidhormone，biocllromeandtheirderivatives，it

7、alsoplaysimportantrolesinmanyfieldsofindustry，includingdetoxificationwinestabilizationpaperprocessing，andenzymaticconversionofchemicalintermediatesToconstructtheheterologousexpressivesystemofalaccascgeneGILCClfromGanoder

8、malucidumisnecessaryforthefurtherstudyofitscharacterizationandfunctionLaccasesarestrongoxidizingenzymesthatoxidizechlorinatedphenols，syntheticdyes，pesticidesandpolycyclicaromatichydrocarbonsaswellasaverywiderangeofotherc

9、ompoundswithhighredoxpotentialAccordingtoayeastbiascodonalaccasegeneGILCCIfromGanodermalucidumWassuccessfullysynthesizedthroughaPCRbasedtwostepDNAsynthesismethodffTDS)andWasoverexpressedinPichiapastoriswithanalcoholoxida

10、selpromoter似OX1)TherecombinantproteinGILCCIWasestimatedtohaveamolecularweightofapproximately58kDaTheKmvaluesofG1LCCIfor22’azinobis(3ethylbenzothiazolineOsulphonicacid)(ABTS)andguaiacolwere09665mM，11122mMrespectivelyandth

11、eV懈ofG1LCCIforthesesubstrateswere3024BMmg‘1min～and8213gMmg‘1min～，respectivelyWithABTSassubstrate，theenzymehadanoptimaltemperatureofaround55。C，activityoverabroadrange(pn2to8)TheenzymeWasstronglyactivatedbyK_，Na，Cu2andmann