中華水蛇PLIγ在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及活性測(cè)定.pdf

1、磷脂酶 A2是一類(lèi)可催化細(xì)胞膜和脂蛋白磷脂二位酰基（Sn-2）水解，釋放溶血磷脂及游離脂肪酸的酶族，從而參與人體花生四烯酸通路，進(jìn)一步的產(chǎn)生大量的炎癥因子，造成機(jī)體損傷。磷脂酶 A2在生物個(gè)體中分布廣泛，在多種蛇類(lèi)蛇毒中已發(fā)現(xiàn)多種類(lèi)型的PLA2，含量豐富，毒性多樣，表現(xiàn)出細(xì)胞毒性、神經(jīng)毒性、肌肉毒性以及出血毒性等多種毒性，可以作為開(kāi)發(fā)抗蛇毒藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，一些種類(lèi)的蛇的肝臟可以表達(dá)一種蛋白質(zhì)，可以特異性中和蛇毒組分 PLA2

2、，從而保護(hù)自己不被自身毒液所傷害，這種蛋白稱為 PLA2抑制劑（ phospholipase A2 inhibitors, PLI）。實(shí)驗(yàn)室前期研究中，我們從中華水蛇血清中純化得到一個(gè)新PLIγ，它對(duì)五步蛇svPLA2酶活性和出血毒均有強(qiáng)抑制效果。由于蛇資源缺乏且血量較少，從中提取大量 PLI較為困難，實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建中華水蛇PLIγ原核表達(dá)系統(tǒng)，但蛋白以沒(méi)有生物活性的包涵體形式存在，復(fù)性效率低，對(duì)其酶活有所影響，故將采用真核表達(dá)方式得到

3、中華水蛇PLIγ。
　　目的：
　　為更加方便快捷的得到活性更高的中華水蛇PLIγ蛋白，構(gòu)建pPICZαA-PLIγ重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤酵母中進(jìn)行真核表達(dá)，進(jìn)一步的進(jìn)行活性測(cè)定，為開(kāi)發(fā)新型抗蛇毒藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　采用瓊脂糖活性平板實(shí)驗(yàn)，根據(jù)形成透明圈的面積，檢測(cè)中華水蛇血清PLIγ對(duì)3種蛇毒酶活的抑制活性；分別向小鼠皮下注射3種蛇毒粗毒，造成小鼠皮下出血形成血斑，注射天然血清與蛇毒混合溶液，比較

4、出血斑的大小，從而證明中華水蛇天然PLIγ的廣譜抗蛇毒作用。
　　設(shè)計(jì)分別帶有EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)的上下游引物，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28c(+)-PLIγ進(jìn)行擴(kuò)增，從而得到全長(zhǎng)為570 bp的PLIγ基因，經(jīng)雙酶切之后，連接至酵母表達(dá)載體pPICZαA上，轉(zhuǎn)化至DH5α中進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)置參數(shù)1.5 KV，25μF，電轉(zhuǎn)時(shí)間5 ms，將線性化后pPICZαA-PLIγ重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母 GS115中

5、，利用博來(lái)霉素篩選陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性克隆酵母DNA，利用PCR進(jìn)行鑒定。在30℃、250 rpm條件下，使用終濃度0.5％甲醇對(duì)篩選的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)，連續(xù)培養(yǎng)120 h，每隔24 h收集發(fā)酵液上清， western bolt使用anti-His抗體檢測(cè)目的蛋白PLIγ表達(dá)效果，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。
　　采用鎳柱親和層析分離純化 PLIγ，SDS-PAGE檢測(cè)純度。使用瓊脂糖平板法檢測(cè)PLIγ對(duì)五步蛇毒粗毒酶活的抑制作用，測(cè)量透明圈直

6、徑，計(jì)算抑制率。利用小鼠皮下注射實(shí)驗(yàn)，對(duì)比血斑面積，檢測(cè)PLIγ對(duì)五步蛇粗毒的出血毒性抑制效果。
　　結(jié)果：
　　在針對(duì)五步蛇毒和蝮蛇蛇毒的瓊脂糖平板實(shí)驗(yàn)中，中華水蛇PLIγ實(shí)驗(yàn)組透明圈直徑減小。在眼鏡蛇粗毒組，中華水蛇PLIγ實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，透明圈直徑無(wú)明顯變化。在小鼠皮下注射實(shí)驗(yàn)中，注射中華水蛇PLIγ蛋白致使五步蛇毒和蝮蛇毒的造成的出血斑的面積減小。在眼鏡蛇毒組，注射中華水蛇PLIγ蛋白使小鼠的存活時(shí)間延長(zhǎng)0.

7、5-1 h。
　　成功從pET28c(+)-PLIγ質(zhì)?？寺〉玫侥康幕?，長(zhǎng)度為570 bp，并經(jīng)過(guò)雙酶切構(gòu)建pPICZαA-PLIγ重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)PLIγ基因沒(méi)有發(fā)生任何突變。重組質(zhì)粒經(jīng)ScaI酶線性化，成功電轉(zhuǎn)至酵母GS115細(xì)胞中，在含博來(lái)霉素平板上長(zhǎng)出菌落，PCR鑒定其為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。甲醇誘導(dǎo)，取發(fā)酵液上清，通過(guò)western bolt檢測(cè)到目的蛋白PLIγ的表達(dá)，在23 kDa左右處出現(xiàn)條帶，并在培養(yǎng)時(shí)間為72 h

8、時(shí)蛋白表達(dá)量最多。發(fā)酵液經(jīng)親和層析分離純化后，SDS-PAGE檢測(cè)得到單一PLIγ蛋白條帶。瓊脂糖活性平板實(shí)驗(yàn)中，PLIγ使透明圈面積減小，對(duì)五步蛇毒酶活的抑制效率為84%。五步蛇毒小鼠背部出血試驗(yàn)中， PLIγ顯著改善血管破損癥狀，出血斑面積減小。
　　結(jié)論：
　　中華水蛇PLIγ對(duì)蛇毒粗毒的酶活性和出血毒性、神經(jīng)毒性有較好抑制效果，具有廣譜抗蛇毒作用。pPICZαA-PLIγ重組質(zhì)粒在酵母GS115細(xì)胞中，可被甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)