中華水蛇PLIγ在畢赤酵母中的表達、純化及活性測定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、磷脂酶 A2是一類可催化細胞膜和脂蛋白磷脂二位?;⊿n-2)水解,釋放溶血磷脂及游離脂肪酸的酶族,從而參與人體花生四烯酸通路,進一步的產(chǎn)生大量的炎癥因子,造成機體損傷。磷脂酶 A2在生物個體中分布廣泛,在多種蛇類蛇毒中已發(fā)現(xiàn)多種類型的PLA2,含量豐富,毒性多樣,表現(xiàn)出細胞毒性、神經(jīng)毒性、肌肉毒性以及出血毒性等多種毒性,可以作為開發(fā)抗蛇毒藥物的關(guān)鍵靶點。據(jù)研究發(fā)現(xiàn),一些種類的蛇的肝臟可以表達一種蛋白質(zhì),可以特異性中和蛇毒組分 PLA2

2、,從而保護自己不被自身毒液所傷害,這種蛋白稱為 PLA2抑制劑( phospholipase A2 inhibitors, PLI)。實驗室前期研究中,我們從中華水蛇血清中純化得到一個新PLIγ,它對五步蛇svPLA2酶活性和出血毒均有強抑制效果。由于蛇資源缺乏且血量較少,從中提取大量 PLI較為困難,實驗室前期構(gòu)建中華水蛇PLIγ原核表達系統(tǒng),但蛋白以沒有生物活性的包涵體形式存在,復(fù)性效率低,對其酶活有所影響,故將采用真核表達方式得到

3、中華水蛇PLIγ。
  目的:
  為更加方便快捷的得到活性更高的中華水蛇PLIγ蛋白,構(gòu)建pPICZαA-PLIγ重組表達載體,轉(zhuǎn)化進畢赤酵母中進行真核表達,進一步的進行活性測定,為開發(fā)新型抗蛇毒藥物奠定基礎(chǔ)。
  方法:
  采用瓊脂糖活性平板實驗,根據(jù)形成透明圈的面積,檢測中華水蛇血清PLIγ對3種蛇毒酶活的抑制活性;分別向小鼠皮下注射3種蛇毒粗毒,造成小鼠皮下出血形成血斑,注射天然血清與蛇毒混合溶液,比較

4、出血斑的大小,從而證明中華水蛇天然PLIγ的廣譜抗蛇毒作用。
  設(shè)計分別帶有EcoR I和Not I酶切位點的上下游引物,對實驗室前期構(gòu)建的原核表達載體pET28c(+)-PLIγ進行擴增,從而得到全長為570 bp的PLIγ基因,經(jīng)雙酶切之后,連接至酵母表達載體pPICZαA上,轉(zhuǎn)化至DH5α中進行擴增。設(shè)置參數(shù)1.5 KV,25μF,電轉(zhuǎn)時間5 ms,將線性化后pPICZαA-PLIγ重組質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母 GS115中

5、,利用博來霉素篩選陽性克隆。提取陽性克隆酵母DNA,利用PCR進行鑒定。在30℃、250 rpm條件下,使用終濃度0.5%甲醇對篩選的轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo),連續(xù)培養(yǎng)120 h,每隔24 h收集發(fā)酵液上清, western bolt使用anti-His抗體檢測目的蛋白PLIγ表達效果,確定最佳誘導(dǎo)時間。
  采用鎳柱親和層析分離純化 PLIγ,SDS-PAGE檢測純度。使用瓊脂糖平板法檢測PLIγ對五步蛇毒粗毒酶活的抑制作用,測量透明圈直

6、徑,計算抑制率。利用小鼠皮下注射實驗,對比血斑面積,檢測PLIγ對五步蛇粗毒的出血毒性抑制效果。
  結(jié)果:
  在針對五步蛇毒和蝮蛇蛇毒的瓊脂糖平板實驗中,中華水蛇PLIγ實驗組透明圈直徑減小。在眼鏡蛇粗毒組,中華水蛇PLIγ實驗組與陽性對照組相比,透明圈直徑無明顯變化。在小鼠皮下注射實驗中,注射中華水蛇PLIγ蛋白致使五步蛇毒和蝮蛇毒的造成的出血斑的面積減小。在眼鏡蛇毒組,注射中華水蛇PLIγ蛋白使小鼠的存活時間延長0.

7、5-1 h。
  成功從pET28c(+)-PLIγ質(zhì)??寺〉玫侥康幕?,長度為570 bp,并經(jīng)過雙酶切構(gòu)建pPICZαA-PLIγ重組質(zhì)粒,經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)PLIγ基因沒有發(fā)生任何突變。重組質(zhì)粒經(jīng)ScaI酶線性化,成功電轉(zhuǎn)至酵母GS115細胞中,在含博來霉素平板上長出菌落,PCR鑒定其為陽性轉(zhuǎn)化子。甲醇誘導(dǎo),取發(fā)酵液上清,通過western bolt檢測到目的蛋白PLIγ的表達,在23 kDa左右處出現(xiàn)條帶,并在培養(yǎng)時間為72 h

8、時蛋白表達量最多。發(fā)酵液經(jīng)親和層析分離純化后,SDS-PAGE檢測得到單一PLIγ蛋白條帶。瓊脂糖活性平板實驗中,PLIγ使透明圈面積減小,對五步蛇毒酶活的抑制效率為84%。五步蛇毒小鼠背部出血試驗中, PLIγ顯著改善血管破損癥狀,出血斑面積減小。
  結(jié)論:
  中華水蛇PLIγ對蛇毒粗毒的酶活性和出血毒性、神經(jīng)毒性有較好抑制效果,具有廣譜抗蛇毒作用。pPICZαA-PLIγ重組質(zhì)粒在酵母GS115細胞中,可被甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)

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