一 人α-synuclein cDNA克隆及異源表達(dá)研究;二 Chloroperoxidase基因在畢赤酵母系統(tǒng)的表達(dá)研究.pdf

1、α-synuclein主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸前末梢。該蛋白目前已受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注，主要原因在于發(fā)現(xiàn)它的功能異常與幾種神經(jīng)退行性疾病，如帕金森氏病(parkinson’s disease，PD)、路易體癡呆(dementia with Lewy bodies，DLB)和老年性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)有關(guān)。α-synuclein的生理功能至今仍不完全清楚。有一些報(bào)道顯示：α-synuclein與神經(jīng)

2、細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和可塑性有關(guān)，并具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用和分子伴侶樣功能，它還參與了信號(hào)傳導(dǎo)過程。但其他一些報(bào)道則表明，它的異常積累和聚集將導(dǎo)致α-synuclein類疾病，如PD的發(fā)生，而且這是一個(gè)由環(huán)境或遺傳因素觸發(fā)的級(jí)聯(lián)(cascade)反應(yīng)，包括α-synuclein的錯(cuò)誤折疊與正常功能的喪失。在高濃度時(shí)，α-synuclein(以及它的突變體形式A53T和A30P)有自我聚集的傾向，導(dǎo)致寡聚體初原纖維、原纖維和多聚體的形成。有證

3、據(jù)顯示兩種突變體形成初原纖維的速率高于其野生型蛋白，而A30P形成原纖維的速率較低，A53T形成原纖維的速率較高。α-synuclein的寡聚體(protofibril)被認(rèn)為具有神經(jīng)細(xì)胞毒性，能引起細(xì)胞凋亡。鑒于α-synuclein具有上述病理學(xué)特征，且神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)α-synuclein聚集體的形成又是幾種神經(jīng)退行性疾病，如PD的一個(gè)特性，α-synuclein有可能被作為一個(gè)潛在的靶點(diǎn)用于新型抗PD藥物的尋找。 本文從人骨髓

4、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y中成功克隆到α-synuclein編碼序列并完成A53T點(diǎn)突變，后者將被用于構(gòu)建PD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表達(dá)載體。同時(shí)在畢赤酵母中成功表達(dá)了人α-synuclein的A53T突變蛋白，并初步觀察了A53T突變型α-synuclein在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長的影響。 以多巴胺誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞總RNA為模板，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增了人α-synuclein包含編碼區(qū)的cDNA片段，核苷酸序列分析表

5、明擴(kuò)增片段與GenBank報(bào)道序列完全一致。將目的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，使Ala53→Thr，將獲得的突變基因進(jìn)行以下研究： 1)亞克隆到pcDNA3.0，構(gòu)建含BGH polyA site的重組質(zhì)粒，用于進(jìn)一步構(gòu)建PD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物重組表達(dá)質(zhì)粒。每一步得到的亞克隆經(jīng)序列測(cè)定與比對(duì)，準(zhǔn)確無誤。 2)將α-synuclein A53T編碼區(qū)序列插入到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K的α-因子信號(hào)肽編碼基因序列下游，構(gòu)建重組質(zhì)粒p

6、PIC9K-Sym；進(jìn)一步構(gòu)建含有綠色螢光蛋白(GFP)融合基因的重組質(zhì)粒pPIC9K-SyGFP。重組質(zhì)粒用Sac Ⅰ線性化后，采用電擊方法轉(zhuǎn)入畢赤酵母感受態(tài)(Pichia Pastoris GS115)細(xì)胞。利用MD培養(yǎng)基和含有G418的YPD培養(yǎng)基篩選出His<'+>Mut<'+>轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定后，用BMMYC培養(yǎng)基培養(yǎng)，以終濃度為1％(v/v)的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵夜上清經(jīng)過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入pPIC9K-

7、SyGFP的轉(zhuǎn)化子在40kDa處有特異蛋白條帶，而轉(zhuǎn)入pPIC9K-Sym的轉(zhuǎn)化子在20kDa處有蛋白條帶。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)表達(dá)蛋白為重組人α-synuclein。 3)將α-synuclein A53T編碼區(qū)序列亞克隆到畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5K上，構(gòu)建胞內(nèi)重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-Sym和pPIC3.5K-SyGFP，用上述方法轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)(PichiaPastoris GS115)細(xì)

8、胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選。甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，用熒光顯微鏡觀察到含pPIC3.5K-SyGFP的重組菌株產(chǎn)生綠色熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷，融合蛋白表達(dá)量很高，并且主要集中在細(xì)胞質(zhì)。轉(zhuǎn)化子經(jīng)液體及固體培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)后，沒有見到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，生長反而比較旺盛，其原因可能在于轉(zhuǎn)化子尚缺乏一定的環(huán)境和遺傳方面的條件。鑒于某些基因缺失突變會(huì)顯著增加酵母對(duì)α-synuclein的敏感性(增強(qiáng)α-synuclein毒性)，對(duì)GS115/pPIC3.5K-SyGF