櫻桃蕃茄中果膠酯酶的基因克隆及在畢赤酵母中表達(dá)的初步研究.pdf

1、低甲氧基果膠在食品、醫(yī)藥等行業(yè)有著比高甲氧基果膠更為廣泛的作用。果膠酯酶(Pectin esterase，Pectin Methyl esterase,Pectin demethoxylaseor Pectin Methoxylase,E．C．3．1．1．11)是果膠復(fù)合酶的一種，作為一種高效的生物催化劑，不同來(lái)源的果膠酯酶可以迅速的從果膠分子的還原性末端或者鄰近的游離羧基開(kāi)始，定向攻擊甲氧基，進(jìn)行去甲基化反應(yīng)，從而達(dá)到將從植物中提取的

2、含量較高的高甲氧基果膠轉(zhuǎn)化為低甲氧基果膠的目的。果膠酯酶的存在廣泛，不但存在于大量的植物中，在一些霉菌和細(xì)菌中也可以分離出果膠酯酶，將其運(yùn)用在低甲氧基果膠的生產(chǎn)中避免了酸法、堿法、酰胺化法生產(chǎn)果膠帶來(lái)的污染大，成本高、循環(huán)性差的弊端，因此，酶法生產(chǎn)低甲氧基果膠成為研究低甲氧基果膠生產(chǎn)方法的熱點(diǎn)。 目前，有很多果膠酯酶研究的相關(guān)報(bào)道，并有在柑桔、蕃茄、豆芽等生物中成功提取并克隆出果膠酯酶基因的先例，但都并未進(jìn)一步的分析。本研究是選

3、取自種原產(chǎn)于南美洲的櫻桃番茄(Lycopersicon esculentum)不同成熟階段的果實(shí)、項(xiàng)尖嫩葉和花蕾提取櫻桃蕃茄的總RNA，通過(guò)特異性引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出含有蕃茄果膠酯酶基因全長(zhǎng)的cDNA，并將其與載體鏈接，進(jìn)行序列分析，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA，轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞，對(duì)畢赤酵母中的外源基因進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化畢赤酵母分泌的果膠酯酶的活性，其研究主要過(guò)程如下： 1．櫻桃番茄(Lycopersico

4、n esculentum)果實(shí)、頂尖嫩葉和花蕾中的總RNA提取和鑒定。 2.采用RT-PCR法：將櫻桃蕃茄果膠酯酶的mRNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA第一鏈并設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得櫻桃蕃茄果膠酯酶基因片斷。 3.構(gòu)建測(cè)序載體PT-PEM，提取質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切及PCR分析和序列測(cè)定，證明櫻桃蕃茄果膠酯酶基因提取成功。 4.構(gòu)建pPiCZαA-PME重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS-115，在含有Zeocin<'TM>的選

5、擇性YEPD平板中篩選到重組酵母，并提取重組酵母的DNA進(jìn)行PCR.反應(yīng)，確定重組酵母基因中含有果膠酯酶基因片斷。 5.對(duì)畢赤酵母中外源基因進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)發(fā)酵上清液的果膠酯酶活性進(jìn)行測(cè)定。 在櫻桃蕃茄果膠酯酶基因克隆和在畢赤酵母中表達(dá)的試驗(yàn)中，我們得到了一條長(zhǎng)為1942bp的果膠酯酶基因，酶切、電泳、測(cè)序，將所得基因序列提交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology