玉米灌漿期胚乳發(fā)育分子調(diào)控分析.pdf

1、玉米為世界三大糧食作物之一，同時(shí)又是重要的飼料和工業(yè)原料。玉米籽粒胚乳是積累和貯藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的場(chǎng)所，占籽粒重量的80％以上，胚乳細(xì)胞的發(fā)育、增殖和充實(shí)情況決定了籽粒的重量和品質(zhì)。然而胚乳發(fā)育是個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生理生化過程，涉及了細(xì)胞的分裂和分化，器官的決定和形成，以及物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和積累等，其中物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和積累甚為重要。前人研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄因子、植物激素、甲基化等對(duì)胚乳發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。同時(shí)前期部分研究也暗示microRNA(miRNA)可

2、能參與調(diào)控胚乳發(fā)育。灌漿期是物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和積累的關(guān)鍵時(shí)期，前期對(duì)玉米胚乳發(fā)育的調(diào)控也有部分研究，但在玉米灌漿期從轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)胚乳發(fā)育系統(tǒng)性的研究還鮮見報(bào)道。因此本文通過解析轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、表觀水平對(duì)灌漿期胚乳發(fā)育的調(diào)控，豐富我們對(duì)灌漿期胚乳發(fā)育所涉及的精細(xì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，更為深入細(xì)致地了解胚乳發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。
　　本研究選用玉米自交系Mo17授粉后7天、9天、10天、11天、13天、15天、20天的胚乳為材料，通過轉(zhuǎn)錄組

3、測(cè)序、miRNA高通量測(cè)序、BS-seq，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，分析灌漿期胚乳發(fā)育過程中的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。并采用RT-PCR技術(shù)、酵母單雜交技術(shù)、瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過本研究，獲得以下研究結(jié)果:
　　(1)通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從7個(gè)玉米胚乳樣品中共檢測(cè)出的35915個(gè)基因至少在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)，其中7095個(gè)基因差異表達(dá)(p＜0.01)，差異表達(dá)基因在7至9天(2873)和9至10天(2720)富集，這可能與玉米胚乳9天開始合成

4、淀粉等儲(chǔ)藏物質(zhì)有關(guān)。差異表達(dá)基因的pathway分析結(jié)果顯示，差異基因主要參與糖和淀粉代謝，細(xì)胞壁形成，激素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，氧化還原反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控等途徑。
　　(2)在淀粉合成關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子序列中，24個(gè)順式作用元件顯著富集，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子與淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)之間的相關(guān)分析，構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過生物信息學(xué)篩選到一個(gè)MYB家族轉(zhuǎn)錄因子MYB127可調(diào)控8個(gè)淀粉合成相關(guān)酶基因表達(dá)。采用酵母單雜交及胚乳中過表達(dá)MYB127蛋白提

5、高淀粉去分支酶(Isa1)基因啟動(dòng)子活性的方法，證明MYB127可上調(diào)淀粉去分去酶Isa1基因表達(dá)。
　　(3) miRNA高通量測(cè)序共鑒定到23個(gè)已知miRNA保守家族的113個(gè)已知miRNA。定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示miRNA表達(dá)趨勢(shì)與miRNA高通量測(cè)序結(jié)果基本一致。結(jié)合生物信息預(yù)測(cè)和miRNA與靶基因表達(dá)量的相關(guān)性分析，共鑒定到70個(gè)已知miRNA的靶基因。通過GO和KEGG pathway注釋，這些靶基因主要參與植物信號(hào)轉(zhuǎn)

6、導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、過氧化物酶體等。
　　(4) miRNA差異表達(dá)分析顯示，屬于11個(gè)家族的28個(gè)miRNA在胚乳發(fā)育過程中差異表達(dá)（P＜0.01），包括miR528、miR393、miR167、miR172、miR1432、miR156、miR171、miR319、miR159、miR398、miR408。miRNA167通過靶基因生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(ARF)調(diào)控糖和淀粉等代謝途徑。miR159和miR319通過靶基因MYB49調(diào)控赤霉

7、素信號(hào)途徑。
　　(5)通過高通量測(cè)序獲得22個(gè)新miRNA,屬于13個(gè)miRNA家族。莖環(huán)PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，其中7個(gè)miRNA家族的轉(zhuǎn)錄因子能在胚乳中成功克隆。
　　(6)我們?cè)谂呷橹袡z測(cè)到CG、CHG、CHH三種形式的甲基化水平分別為73％-81％、56％-68％、2％-3％;在授粉后13天的穗位葉中檢測(cè)到CG、CHG、CHH三種形式的甲基化水平分別為82.50％、74.42％、3.05％，遠(yuǎn)高于水稻、擬南芥等植物的甲