不同類型玉米自交系胚乳發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期差異表達(dá)基因的分離與克隆.pdf

1、玉米胚乳占籽粒重量的80％以上，胚乳細(xì)胞的發(fā)育、增殖和充實(shí)狀況決定著籽粒的重量和品質(zhì)。前人對(duì)玉米籽粒胚乳的研究主要集中在籽粒淀粉的特性及其合成過(guò)程中關(guān)鍵酶的作用方面，對(duì)籽粒胚乳不同時(shí)期發(fā)育機(jī)理，特別是分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)還十分有限。本研究以粒重差異較大的爆裂玉米自交系N04和馬齒型普通玉米自交系丹232為材料，在研究其籽粒灌漿進(jìn)程的基礎(chǔ)上，確定胚乳發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期，采用抑制差減雜交技術(shù)，批量克隆了兩個(gè)自交系胚乳發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期差異表達(dá)的EST，并對(duì)部

2、分EST進(jìn)行了差異表達(dá)驗(yàn)證、電子定位和比較基因組學(xué)分析。另外，還克隆了一個(gè)GTP結(jié)合蛋白的Arf家族基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并分析了其在N04胚乳發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況和組織特異性。研究結(jié)果不僅有助于挖掘不同類型玉米胚乳發(fā)育相關(guān)基因，揭示胚乳發(fā)育和籽粒形成的分子機(jī)理，更重要的是為粒重候選基因的挖掘、以及利用基因工程方法提高粒重和改良品質(zhì)提供了新基因貯備、高水平的材料平臺(tái)和理論依據(jù)。 主要結(jié)果如下： 1.采用Richards

3、方程擬合小粒爆裂玉米自交系N04和大粒馬齒型普通玉米自交系丹232籽粒灌漿過(guò)程，結(jié)果表明，自交系N04的起始生長(zhǎng)勢(shì)較大，最大灌漿速度較小，到達(dá)最大灌漿速度的時(shí)間較早；自交系丹232的起始生長(zhǎng)勢(shì)小，最大灌漿速度較大，到達(dá)最大灌漿速度的時(shí)間較晚，活躍生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，平均灌漿速率和最大灌漿速率時(shí)的百粒重較大，說(shuō)明兩個(gè)自交系籽粒灌漿過(guò)程中各種代謝活動(dòng)差異較大。從胚乳、胚、果皮的鮮重和干重的動(dòng)態(tài)變化可以看出，授粉后10d(10DAP)至20d(20D

4、AP)是胚乳發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。兩個(gè)自交系胚乳發(fā)育的顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，N04和丹232在10 DAP處于細(xì)胞分裂階段，之后胚乳細(xì)胞內(nèi)含物快速增長(zhǎng)，20 DAP胚乳細(xì)胞充滿淀粉粒。N04胚乳發(fā)育成硬質(zhì)型，丹232胚乳發(fā)育成粉質(zhì)型，兩個(gè)自交系的胚乳結(jié)構(gòu)存在較大差異。綜合考慮以上研究結(jié)果，確定選取兩個(gè)自交系10 DAP和20 DAP兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的胚乳進(jìn)一步研究其差異表達(dá)基因。 2.利用抑制差減雜交方法，分別構(gòu)建了自交系NO4和丹232 1

5、0 DAP和20 DAP胚乳的正反向4個(gè)抑制差減雜交庫(kù)，分別富集了N04胚乳早期、NO4胚乳中期、丹232胚乳早期和丹232胚乳中期增強(qiáng)表達(dá)的基因。對(duì)其進(jìn)行反向Northern雜交驗(yàn)證后測(cè)序，獲得902個(gè)非重復(fù)序列。用BioEdit和ClustalW軟件分別進(jìn)行多序列的重疊分析，共得到344個(gè)UniqueESTs，包括204個(gè)Contigs和140個(gè)Singletons。根據(jù)Blastx分析結(jié)果，去除4個(gè)差減文庫(kù)之間的重復(fù)序列，共得到了

6、160個(gè)不同的EST序列，推測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)與其他物種已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有很高的相似性，有20％的差異表達(dá)基因?yàn)楣δ芪粗蛐掳l(fā)現(xiàn)的EST。功能已知的EST涉及代謝途徑的多個(gè)方面，包括20％的基礎(chǔ)代謝、5.21％的轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控(包括3.75％的轉(zhuǎn)錄因子)、2.6％的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、3％的細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂、26.04％的蛋白加工和5.73％的物質(zhì)運(yùn)輸?shù)认嚓P(guān)基因。 3.利用電子定位和比較基因組學(xué)的方法將差異表達(dá)EST定位到玉米染色體上，

7、并與前人定位的粒重QTL位點(diǎn)進(jìn)行了比較分析。70條定位上的ESTs分布在玉米十條染色體上，其中第4染色體上定位的ESTs最多，占24.29％，第10染色體上定位的ESTs最少，占2.86％。9條ESTs位于已定位粒重QTL所在的標(biāo)記區(qū)間，占總定位ESTs的12.9％，并分別位于第1、2、3、6、7和8染色體上。兩條ESTs PEl2C5和PEl5C3共同定位到利用與本研究相同的兩個(gè)自交系定位百粒重QTL的標(biāo)記區(qū)間，推測(cè)其分別編碼鋅指家族

8、蛋白和GTP結(jié)合蛋白。 4.采用電子克隆結(jié)合RT-PCR的方法驗(yàn)證、分離克隆了一個(gè)GTP結(jié)合蛋白的全長(zhǎng)eDNA序列。序列長(zhǎng)938 bp，編碼區(qū)609 bp，5'-非編碼區(qū)有237 bp，3'-非編碼區(qū)有89 bp，編碼202個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)分子量為22.77 KD，等電點(diǎn)是6.13，前15個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，具有小G蛋白Arf家族基因的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)還含有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)域。該基因在自交系N04胚乳發(fā)育早期表達(dá)量