有機(jī)磷降解酶基因(opdA)在大腸桿菌與枯草芽孢桿菌中的表達(dá)與酶學(xué)研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphates, OPs)具有殺蟲(chóng)效率高、防治范圍廣、成本低等特點(diǎn),在保護(hù)農(nóng)作物免受病蟲(chóng)害侵染、提高糧食產(chǎn)量等方面發(fā)揮了巨大作用。但它們對(duì)人類的生存環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染,并導(dǎo)致瓜果與蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo),直接危害人類與動(dòng)物的健康。所以有機(jī)磷農(nóng)藥降解方面的研究在環(huán)境保護(hù)和食品安全方面受到了高度關(guān)注。
　　研究發(fā)現(xiàn),一些能降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌的降解作用是通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)磷降解酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而直接使用此類有

2、機(jī)磷降解酶降解有機(jī)磷農(nóng)藥的效率遠(yuǎn)高于使用產(chǎn)生此類酶的降解菌。
　　來(lái)源于土壤桿菌屬Agrobacterium radiobacter P230的有機(jī)磷降解酶(OpdA)具有底物范圍廣和催化效率高的特點(diǎn),因此被公認(rèn)為是迄今為止最具有應(yīng)用前景的有機(jī)磷降解酶。有機(jī)磷降解酶通過(guò)水解有機(jī)磷農(nóng)藥的磷脂鍵,最終實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的無(wú)毒化。本研究旨在利用已有的研究基礎(chǔ),建立有機(jī)磷降解酶基因(opdA)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)其高效表達(dá);同時(shí)對(duì)枯草芽孢桿

3、菌的電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化,建立高效的電轉(zhuǎn)化方法,并構(gòu)建有機(jī)磷降解酶基因(opdA)在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)系統(tǒng),克服重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以包涵體的形式在胞質(zhì)中形成造成重組蛋白復(fù)性困難這一難題。
　　1.有機(jī)磷降解酶基因(opdA)在大腸桿菌中的高效表達(dá)與酶學(xué)研究
　　使用限制性內(nèi)切酶Xho I和BamHI雙酶切目的片段與表達(dá)質(zhì)粒,將擴(kuò)增的opdA基因定向插入到原核表達(dá)載體pET-28b中,構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pET-2

4、8b-opdA,并將其轉(zhuǎn)化到E. coli BL21(DE3)中獲得重組工程菌株,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)高效表達(dá),并對(duì)重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果是:誘導(dǎo)前菌液OD600的吸光值為0.5時(shí),經(jīng)1.25 mmol/L IPTG在37℃下誘導(dǎo)表達(dá)5h,重組蛋白表達(dá)量最大。重組蛋白OpdA對(duì)甲基對(duì)硫磷的Km值為42.6μmol/L,其Vmax為32.669μmol/L·min。比酶活為24.48U/mg。
　　2.枯草芽孢桿菌電

5、轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化研究
　　將穿梭質(zhì)粒pHY300PLK電轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌,對(duì)電轉(zhuǎn)化條件GM培養(yǎng)基、EM培養(yǎng)基、RM培養(yǎng)基、電擊時(shí)電場(chǎng)強(qiáng)度、質(zhì)粒濃度進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是:在GM-2培養(yǎng)基(LB+0.5 M sorbitol)、EM-6培養(yǎng)基(0.5 M sorbitol+0.5 M mannitol+10％Glycero)、RM-6(LB+0.5 M sorbitol+0.38 M mannitol)、電擊電壓為2.0KV、質(zhì)粒濃度

6、為100 ng/μl條件下,電轉(zhuǎn)化率最高,枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化率為1.45x103個(gè)/μg DNA。
　　3.有機(jī)磷降解酶基因(opdA)在枯草芽孢桿菌中的高效分泌表達(dá)與酶學(xué)研究
　　利用人工合成方法的獲得opdA基因,構(gòu)建表達(dá)載體pHT43-opdA,并將其轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB800N中獲得重組工程菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是:誘導(dǎo)前菌液OD600的吸光值達(dá)到0.7時(shí),經(jīng)1.25 mmol/L的IPTG在37℃下誘導(dǎo)27h,實(shí)現(xiàn)高效分