少根根霉脂肪酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)研究.pdf

1、脂肪酶是醫(yī)藥、化工、食品和化妝品領(lǐng)域的重要原料，是生物技術(shù)及有機(jī)合成方面應(yīng)用最廣泛的一類酶。根霉屬(Rhizopus sp.)微生物是脂肪酶的重要生產(chǎn)菌。根霉脂肪酶大多具有高度的1，3位置專一性，在油脂加工和多種有機(jī)化合物的制備中以其較好的立體選擇性等優(yōu)點(diǎn)受到了關(guān)注。
　　 根霉菌絲體的存在對于根霉屬脂肪酶產(chǎn)物的分離和純化造成了極大的阻礙，所以我們考慮選擇外分泌型表達(dá)宿主克隆表達(dá)根霉屬脂肪酶基因?？莶輻U菌是一種非致病性微生物，對

2、人畜無害，具有完備的分泌系統(tǒng)，能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至細(xì)胞外，有利于外源產(chǎn)物的純化與回收，因此選擇枯草桿菌作為表達(dá)宿主。
　　 本文克隆了Rhizopus arrhizus L-03-R-1的脂肪酶成熟肽基因ral；構(gòu)建了重組表達(dá)載體pGJ103-P43-SP-ral，在枯草芽孢桿菌表達(dá)體系中進(jìn)行了ral基因的組成型分泌表達(dá)探索；后又構(gòu)建了誘導(dǎo)表達(dá)型載體pGJ103-SacB-ral，實(shí)現(xiàn)了基因ral在枯草桿菌中的誘導(dǎo)型分泌表

3、達(dá)，并對誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行了研究。
　　 首先，以少根根霉基因組為模板PCR擴(kuò)增得到800kb的目的基因片段，經(jīng)A-T克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證及序列測定，測定結(jié)果與報(bào)道完全一致；ral基因片段經(jīng)過酶切處理后，與P43-SP啟動(dòng)子-信號序列連接，構(gòu)建成P43-SP-ral基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒經(jīng)過雙酶切后插入到pGJ103質(zhì)粒中，成功構(gòu)建了ral基因的枯草桿菌組成型表達(dá)體系。由SDS-PAGE鑒定表明，目的蛋

4、白在胞內(nèi)有表達(dá)，而在胞外基本沒有表達(dá)。檢測結(jié)果表明，胞內(nèi)目的蛋白僅具有1.5U/ml左右的脂肪酶酶活，其蛋白含量和酶活力在6-12小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。
　　 然后，用三個(gè)蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌作宿主實(shí)現(xiàn)了基因ral在枯草桿菌中的誘導(dǎo)分泌表達(dá)。利用PCR技術(shù)從少根根霉基因組中擴(kuò)增出脂肪酶成熟肽基因ral，并從枯草芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增出sacB基因的啟動(dòng)子-信號序列(SacB)；通過搭橋PCR將SacB序列與ral基因融合，并將該基因

5、表達(dá)盒連接到枯草桿菌分泌表達(dá)載體pGJ103中構(gòu)建了脂肪酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)載體pGJ103-SacB-ral。將重組載體轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌后，少根根霉脂肪酶成熟肽基因在SacB啟動(dòng)子-信號序列的調(diào)控和蔗糖的誘導(dǎo)下獲得表達(dá)，產(chǎn)物分泌至胞外，且具有脂肪酶酶活。
　　 最后，本文探索了不同誘導(dǎo)劑量、不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和不同誘導(dǎo)時(shí)間對蛋白表達(dá)量的影響。研究結(jié)果表明：重組菌培養(yǎng)6h后加入終濃度為2％的蔗糖誘導(dǎo)26h，獲得的目的蛋白量高于其他條件；