二穗短柄草CBF2基因載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗性分析.pdf

1、本文以二穗短柄草CBF2基因和擬南芥為研究對(duì)象，采用gateway技術(shù)構(gòu)建了CBF2基因的植物表達(dá)載體pK24-35S-CBF2，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將其轉(zhuǎn)入擬南芥。在組培條件下，將轉(zhuǎn)化植株的種子進(jìn)行三代篩選，得到純合的陽(yáng)性植株。利用其研究轉(zhuǎn)基因擬南芥種子、幼苗及成苗在干旱、鹽堿脅迫下的生理生化反應(yīng)，探討擬南芥在干旱、鹽堿脅迫下的生理反應(yīng)特性及CBF2基因的功能。實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下：
　　1、使用gateway技術(shù)構(gòu)建CBF2基因的植

2、物表達(dá)載體pK24-35S-CBF2，并通過農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的方法，將二穗短柄草CBF2基因轉(zhuǎn)入擬南芥中。將轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行卡那霉素篩選，一代得到13株陽(yáng)性植株，二代和三代篩選后，得到7個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，萌發(fā)率與轉(zhuǎn)化率皆在80％以上。將7個(gè)株系進(jìn)行PCR鑒定，皆得到目的條帶，即成功獲得7個(gè)轉(zhuǎn)二穗短柄草CBF2基因擬南芥株系。
　　2、取萌發(fā)率和轉(zhuǎn)化率皆在90％以上的3個(gè)T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的種子及植株進(jìn)行抗旱性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果

3、表明在種子階段轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥的抗旱性無明顯差異。幼苗時(shí)期，甘露醇濃度為100、150、200、250、300mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因幼苗根長(zhǎng)增長(zhǎng)量顯著高于野生型幼苗，說明轉(zhuǎn)基因幼苗時(shí)期抗旱性增強(qiáng)。而在苗期的干旱處理中，轉(zhuǎn)基因擬南芥在表型上與野生型有一定差異，表現(xiàn)出了更強(qiáng)的生命力，轉(zhuǎn)基因植株遭遇干旱脅迫后，MDA與外滲電導(dǎo)率值皆顯著低于野生型植株，細(xì)胞膜損傷比野生型擬南芥更小，且植物體內(nèi)的POD酶活性在處理8-20d內(nèi)始終高于野生型擬

4、南芥。說明CBF2基因在一定程度上增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥在幼苗和成苗階段的抗旱能力。
　　3、將T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子及植株進(jìn)行耐鹽性的研究。結(jié)果表明:NaCl濃度為100、150、200mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因各株系的種子萌發(fā)率顯著高于野生型擬南芥。幼苗時(shí)期，隨著NaCl濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因各株系的根長(zhǎng)增長(zhǎng)量顯著高于野生型。轉(zhuǎn)基因擬南芥苗期用150和250mmol/L NaCl處理，隨脅迫天數(shù)增加，轉(zhuǎn)基因植株在表型上表現(xiàn)

5、出了更強(qiáng)的耐鹽能力。而150mmol/L和250mmol/L NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥各株系植株的SOD、POD酶活性在處理的中后期顯著高于野生型植株，且變化趨勢(shì)更平緩。MDA含量與外滲電導(dǎo)率值顯著低于野生型植株，說明CBF2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植物清除活性氧自由基的能力，減輕了轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫下的膜脂過氧化作用。最終發(fā)現(xiàn):在抵御NaCl脅迫的過程中，CBF2基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因擬南芥的各個(gè)生長(zhǎng)階段均有效增強(qiáng)了其耐鹽能力。

6、
　　4、將T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子及植株進(jìn)行NaHCO3協(xié)迫試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):NaHCO3濃度為7.5和10mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥各株系種子萌發(fā)率明顯高于野生型，幼苗時(shí)期NaHCO3濃度為2、5、7.5、10mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因各株系幼苗根長(zhǎng)增長(zhǎng)量顯著高于野生型幼苗。隨著NaHCO3濃度的增加，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株表型差異明顯，且最終成活率明顯高于野生型擬南芥。采用不同濃度NaHCO3處理轉(zhuǎn)基因擬南芥成苗，測(cè)得轉(zhuǎn)基因植株S