番茄PG基因RNA干擾載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、番茄是我國(guó)的主要果蔬之一，屬于呼吸躍變型果實(shí)(Climacteric fruits)，成熟后貯藏期短，依靠生物技術(shù)改良番茄的耐貯性對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品銷(xiāo)售極其重要。多聚半乳糖醛酸酶(PG)是在果實(shí)成熟過(guò)程中特異表達(dá)的細(xì)胞壁水解酶，是一種細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，它的主要功能是將果實(shí)細(xì)胞壁中多聚半乳糖醛酸降解為半乳糖和醛酸，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實(shí)的軟化。RNA干擾(簡(jiǎn)稱(chēng)RNAi)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)使真核生物功能基因表達(dá)水平降低或關(guān)閉的先進(jìn)的生

2、物技術(shù)，以其特異性、高效性和廣泛性的優(yōu)勢(shì)，逐漸成為一項(xiàng)極具潛力的基因功能研究技術(shù)。
　　 本研究分別克隆了PG基因的cDNA序列和啟動(dòng)子區(qū)的DNA序列，設(shè)計(jì)其RNA干擾序列并克隆到植物雙元表達(dá)載體中，分別通過(guò)花粉管通道法和農(nóng)桿菌侵染法將構(gòu)建的RNA干擾植物雙元表達(dá)載體導(dǎo)入番茄細(xì)胞中。以期獲得耐貯轉(zhuǎn)基因番茄植株，為進(jìn)一步市場(chǎng)化奠定堅(jiān)實(shí)的前期研究基礎(chǔ)。研究的主要結(jié)果概述如下：
　　 根據(jù)已發(fā)表的番茄PG基因啟動(dòng)子的核苷酸序列

3、設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，以番茄葉片總DNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到PG基因全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列和5’端缺失序列，然后分別克隆到pUC18載體中。序列分析表明PG基因啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列為1415bp，與已發(fā)表序列只有四個(gè)堿基的差異，同源率為99％。應(yīng)用已設(shè)計(jì)的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，將上述兩個(gè)片段反向連接，形成PG基因啟動(dòng)子的反向重復(fù)序列，并克隆到中間載體pBluescript SK+中；序列分析表明3’端互補(bǔ)區(qū)段的堿基序列完全一致，在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后可以互補(bǔ)配對(duì)

4、結(jié)合，形成hpRNA結(jié)構(gòu)。隨后，將反向重復(fù)序列克隆在植物雙元表達(dá)載體pPGN中，構(gòu)建了PG基因啟動(dòng)子區(qū)的RNA干擾植物雙元表達(dá)載體pNPGIR。并將pNPGIR轉(zhuǎn)化LBA4404，建成了植物轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌。
　　 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，用RT-PCR的方法獲得了番茄PG cDNA全長(zhǎng)序列和5’端缺失序列，將全長(zhǎng)cDNA序列克隆到pBluescript SK+載體中。測(cè)序結(jié)果表明PGcDNA全長(zhǎng)序列為1569 bp，與已發(fā)表的序列只有兩個(gè)

5、堿基的差異，同源率為99％。應(yīng)用已設(shè)計(jì)的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，將上述兩個(gè)片段反向連接，形成PG基因編碼區(qū)的反向重復(fù)序列，將反向重復(fù)序列克隆在植物雙元表達(dá)載體pPGN中，構(gòu)建了PG基因編碼區(qū)的RNA干擾植物雙元表達(dá)載體pNCPG5dLIR。并將pNCPG5dLIR轉(zhuǎn)化LBA4404，建成了植物轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌。
　　 優(yōu)化番茄5個(gè)品種再生體系，其子葉外植體的再生順序?yàn)椋築D>T4>MFg，TJ544>polish Lim，以BD子葉

6、外植體再生率最高。以BD子葉為外植體，確立了適宜的分化培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.6％、適宜的生根培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.6％、遺傳轉(zhuǎn)化中適宜的卡那霉素和頭孢霉素的抑菌濃度分別為6.5 mg/L和150 mg/L。
　　 將含pNCPG5dLIR和pNPGIR的根癌農(nóng)桿菌LBA4404分別轉(zhuǎn)化預(yù)培養(yǎng)2天的BD子葉外植體，當(dāng)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的OD6

7、00為0.6～0.8之間時(shí)，菌液不作稀釋?zhuān)秩拘Ч容^好，此時(shí)的侵染時(shí)間以15 min為宜；共培養(yǎng)2～3天后轉(zhuǎn)至分壓培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。分壓培養(yǎng)基的篩選方式為：不定芽分化固體培養(yǎng)基+Kan6.5mg/L Cef100 mg/L→Kan8.0 mg/L Cef100 mg/L→Kan10 mg/L Cef50mg/L→Kan15 mg/L Cef50 mg/L。
　　 利用花粉管通道法介導(dǎo)番茄的遺傳轉(zhuǎn)化，收獲轉(zhuǎn)基因種子；確立了轉(zhuǎn)基因