二穗短柄草BdWRKY2,BdWRKY7和BdWRKY43基因的克隆、表達(dá)分析和遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、非生物逆境脅迫嚴(yán)重危害多種重要糧食作物（如小麥、大麥和燕麥等）的生長和發(fā)育，進(jìn)而嚴(yán)重降低其產(chǎn)量，因此迫切需要分離非生物逆境反應(yīng)相關(guān)基因、并闡明其功能，通過基因工程手段培育抗性作物新品種。二穗短柄草與小麥同屬于冷季型早熟禾亞科植物，遺傳關(guān)系密切，且二穗短柄草Bd21的全基因組的測序工作已經(jīng)完成，基因克隆方便，是研究小麥功能基因的理想模式植物。轉(zhuǎn)錄因子WRKY是植物十大轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一，能夠調(diào)節(jié)多種農(nóng)藝性狀，其功能涉及發(fā)育、代謝、衰老、生物

2、和非生物逆境脅迫等。因此，二穗短柄草WRKY基因的克隆、表達(dá)模式分析以及遺傳轉(zhuǎn)化研究有望為麥類作物的遺傳改良提供理論支持。
　　本研究克隆了BdWRKY2，BdWRKY7和BdWRKY43基因，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、表達(dá)分析、亞細(xì)胞定位分析、轉(zhuǎn)化煙草以及初步的表型分析的工作。主要研究結(jié)果如下：
　　(1)通過檢索二穗短柄草WRKY基因數(shù)據(jù)庫和植物基因組數(shù)據(jù)庫，獲得BdWRKY2,BdWRKY7和BdWRKY43基因的c

3、DNA和DNA序列，利用Primer Premier5.0設(shè)計目的基因的特異性引物，成功克隆了BdWRKY2/7/43的基因。
　　(2)利用DNAMAN和MEGA5.0對BdWRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多序列比對和進(jìn)化分析，結(jié)果顯示BdWRKY2屬于IIc亞家族，BdWRKY7屬于I家族，BdWRKY43屬于III家族。
　　(3)利用半定量RT-PCR技術(shù)分析目的基因BdWRKY2/7/43的器官差異性和在非生物逆境脅迫及分子信

4、號處理下的表達(dá)水平。結(jié)果表明這3個基因在幼葉中的表達(dá)量都比較高，且均響應(yīng)多種非生物脅迫，具體表現(xiàn)為：
　　BdWRKY2基因受PEG,ABA,NaCl,H2O2,heat的誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)；BdWRKY7基因受PEG,NaCl,H2O2，heat,cold的誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)；BdWRKY43基因受PEG,heat的誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)，受ABA,NaCl,H2O2,cold的誘導(dǎo)，表達(dá)下調(diào)。
　　(4)將已獲得的目的基因BdWRKYs

5、構(gòu)建到pCAMBIA1304表達(dá)載體上，獲得pCAMBIA1304-BdWRKY植物過表達(dá)載體。
　　(5)基因槍介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時表達(dá)分析顯示，轉(zhuǎn)錄因子BdWRKY2，BdWRKY7和BdWRKY43均定位于細(xì)胞核。
　　(6)利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，成功獲得了13株轉(zhuǎn)BdWRKY2、8株轉(zhuǎn)BdWRKY7和12株轉(zhuǎn)BdWRKY43基因的煙草株系。同時，利用半定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步分析了部分BdWRKY2/7/43基因

6、過表達(dá)煙草株系的轉(zhuǎn)錄水平。
　　(7)分析了不同轉(zhuǎn)Bd WRK Y7基因株系后代在干旱脅迫下的表型，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BdWRKY7基因降低了轉(zhuǎn)基因煙草對干旱脅迫的耐受性。
　　本研究成功克隆了BdW RK Y2/7/43基因，并轉(zhuǎn)化了煙草，進(jìn)而分析了部分轉(zhuǎn)基因株系外源基因的轉(zhuǎn)錄水平；另外，還分析了BdWRKY2/7/43基因在非生物脅迫及信號分子處理下的表達(dá)模式，并分析了不同轉(zhuǎn)BdWRKY7基因株系后代在干旱脅迫下的表型，為后續(xù)W