二穗短柄草BdPYL和BdPP2CA基因的克隆及BdPP2CA6抗鹽功能研究.pdf

1、植物在其生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遭遇病害、干旱、冷脅迫、鹽脅迫等多種生物逆境脅迫和非生物逆境物脅迫，這些脅迫影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，造成作物減產(chǎn)甚至絕收。植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜的脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)對(duì)逆境脅迫。脫落酸（Abscisic acid，ABA）是植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中的重要植物激素。近年來(lái)的研究已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中建立了ABA-PYL-PP2C-SnRK2信號(hào)通路調(diào)控模型。但是在二穗短柄草（Brachy

2、podium distachyon）中關(guān)于ABA受體PYL家族和A類(lèi)PP2C亞家族的研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。二穗短柄草作為一種新型單子葉模式植物，與小麥、水稻、玉米等禾谷類(lèi)作物親緣關(guān)系較近，對(duì)二穗短柄草的基因功能研究能為對(duì)這些作物的研究提供參考。本文研究了二穗短柄草A類(lèi)PP2C在ABA信號(hào)通路中的調(diào)控作用及其在非生物逆境脅迫應(yīng)答中的反應(yīng)。首先分離了二穗短柄草PYL家族和A類(lèi)PP2C亞家族成員，基于相互作用和轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析結(jié)果，選定了A類(lèi)PP2C

3、亞家族的成員BdPP2CA6進(jìn)行深入研究。利用遺傳學(xué)手段、生化和分子生物學(xué)研究方法，探究了BdPP2CA6在非生物逆境脅迫中的功能和作用機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　1)二穗短柄草PYL家族和A類(lèi)PP2C亞家族成員的鑒定和生物信息學(xué)分析
　　從二穗短柄草全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出12個(gè)BdPYL基因和86個(gè)BdPP2C基因，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析分離出8個(gè)二穗短柄草A類(lèi)PP2C基因BdPP2CA。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，BdPYL和BdP

4、P2CA各家族成員內(nèi)部的結(jié)構(gòu)域高度保守，對(duì)BdPYL和BdPP2CA基因啟動(dòng)子的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，BdPP2CA1、BdPP2CA6、BdPP2CA7和BdPP2CA8的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)含有很多與ABA有關(guān)的順式作用元件，表明它們可能參與ABA信號(hào)通路。
　　2)BdPYL和BdPP2CA的相互作用分析
　　成功地克隆出12個(gè)BdPYL基因和7個(gè)BdPP2CA基因，并將它們分別構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pGADT7和pGBKT7中，

5、以研究相互作用關(guān)系。發(fā)現(xiàn)只有BdPYL11能在沒(méi)有外源ABA的條件下與BdPP2CA4、BdPP2CA5、BdPP2CA6或BdPP2CA8相
　　互作用。通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了BdPYL11與BdPP2CA4、BdPP2CA5、BdPP2CA6或BdPP2CA8在植物體內(nèi)的相互作用關(guān)系。同時(shí)只有BdPYL11與BdPP2CA6的復(fù)合體定位到細(xì)胞核，其余組合均定位到全細(xì)胞。因此，我們進(jìn)一步研究了這五個(gè)基因。
　　3)

6、轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析和亞細(xì)胞定位分析
　　轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析顯示，在ABA、NaCl或PEG6000處理后，BdPYL11表達(dá)下調(diào)，而B(niǎo)dPP2CA4、BdPP2CA5、BdPP2CA6、BdPP2CA8表達(dá)上調(diào)?；驑屴Z擊洋蔥表皮細(xì)胞的研究表明，BdPYL11、BdPP2CA4、BdPP2CA5和BdPP2CA8定位在細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，而B(niǎo)dPP2CA6則定位在細(xì)胞核。表明BdPP2CA6能將BdPYL11招募到細(xì)胞核發(fā)揮作用。因此，我

7、們最終選擇BdPP2CA6進(jìn)行基因功能分析，并獲得了BdPP2CA6過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。
　　4)BdPP2CA6轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA超敏感
　　使用不同濃度ABA處理擬南芥幼苗發(fā)現(xiàn)，與野生型和轉(zhuǎn)空載型擬南芥相比，BdPP2CA6轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗對(duì)ABA更敏感，并且敏感程度隨ABA濃度提高而升高。ABA瞬時(shí)處理擬南芥葉片發(fā)現(xiàn)，BdPP2CA6轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的氣孔在ABA的刺激下閉合速率更快，表明BdPP2CA6轉(zhuǎn)基因擬南

8、芥對(duì)ABA超敏感。
　　5)BdPP2CA6提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽脅迫耐受性
　　對(duì)擬南芥幼苗和成苗進(jìn)行鹽脅迫處理發(fā)現(xiàn)BdPP2CA6轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)鹽脅迫的耐受性更高。同時(shí)使用NaCl瞬時(shí)處理擬南芥葉片發(fā)現(xiàn)，BdPP2CA6轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的氣孔在鹽處理下閉合速率更快，表明BdPP2CA6提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐受性。
　　6)BdPP2CA6轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽脅迫耐受性的生理分析和相關(guān)基因表達(dá)分析
　　研究

9、發(fā)現(xiàn)BdPP2CA6能顯著提高擬南芥體內(nèi)K+/Na+比，并且是通過(guò)提高擬南芥體內(nèi)K+的積累而不是Na+的積累實(shí)現(xiàn)的。對(duì)BdPP2CA6轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫處理后生理指標(biāo)的測(cè)定表明，BdPP2CA6轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠素和脯氨酸含量均高于野生型擬南芥植株，而丙二醛含量、雙氧水含量和離子滲漏均低于野生型擬南芥。這些結(jié)果說(shuō)明，BdPP2CA6轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫下受到更少的膜損傷和氧化損傷，因而對(duì)鹽脅迫的耐受性更高。對(duì)與ABA信號(hào)通路和鹽脅迫相關(guān)

10、的基因或轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)模式研究表明，ABF2、ABF3、DREB2A、MYB15以及RD26受到鹽脅迫后表達(dá)上調(diào)，并且它們?cè)贐dPP2CA6轉(zhuǎn)基因擬南芥中的上調(diào)程度顯著高于野生型擬南芥，說(shuō)明BdPP2CA6通過(guò)上調(diào)一些與ABA信號(hào)通路和鹽脅迫相關(guān)的基因或轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，正調(diào)控植物響應(yīng)鹽脅迫信號(hào)通路。
　　7)BdPP2CA6與AtSnRK2和BdSnRK2之間的相互作用分析
　　為了研究BdPP2CA6在植物非生物脅迫應(yīng)

11、答中的分子機(jī)理，我們研究了BdPP2CA6與AtSnRK2和BdSnRK2之間的相互作用。結(jié)果表明BdPP2CA6與AtSnRK2.3之間有較強(qiáng)的相互作用，BdPP2CA6與BdSnRK2.2之間則只有較弱的相互作用，并且我們不能通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出這種較弱的相互作用。因此我們推測(cè)BdPP2CA6可能不是通過(guò)調(diào)節(jié)SnRK2來(lái)正調(diào)控植物對(duì)鹽脅迫應(yīng)答和植物體內(nèi)ABA信號(hào)通路。
　　本研究分離并克隆了A類(lèi)PP2C基因BdPP2C