短柄草磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與功能分析.pdf

1、磷是植物體內(nèi)核酸、磷脂和ATP的重要組成成分,同時(shí)也是植物生長(zhǎng)發(fā)育重要的營(yíng)養(yǎng)元素,作為植物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)移的物質(zhì),磷在活化體內(nèi)蛋白質(zhì)、調(diào)控植物體代謝過(guò)程、調(diào)節(jié)植株生長(zhǎng)和抗逆性等方面發(fā)揮重要作用。通常土壤中能為植物吸收的有效磷并不高,不能有效滿足植物生長(zhǎng)發(fā)育的需要。磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物磷的吸收中起著重要作用,尤其是Pht1家族基因,大多為高親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,受低磷調(diào)控并且主要在根部表達(dá)。
　　 本研究利用信息生物學(xué)的手段,預(yù)測(cè)出短柄草中磷

2、轉(zhuǎn)返蛋白基因,結(jié)合同源克隆的方法得到gDNA和cDNA的序列,預(yù)測(cè)出短柄草中Phtl基因家族的成員,并運(yùn)用熒光定量的方法對(duì)Pht1基因家族成員進(jìn)行組織特異性表達(dá)和低磷誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)部分基因構(gòu)建擬南芥和酵母表達(dá)載體,進(jìn)行功能驗(yàn)證。具體結(jié)果如下:
　　 1.借助生物信息學(xué)的方法,對(duì)短柄草的基因組進(jìn)行分析,推測(cè)可能的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因18個(gè),依據(jù)其在染色體上的位置,分別命名為Bd1g00700,Bd1g42610,Bd1g52590,Bd1

3、g67330,Bd1g75020,Bd1g75030,Bd1g76010,Bd2g10810,Bd2g45520,Bd3g12590,Bd3g27680,Bd3g47550,Bd3g57890,Bd4g32020,Bd5g02730,Bd5g02760,Bd5g02770,Bd5g11740。通過(guò)同源克隆的方法得到這18個(gè)基因的gDNA和cDNA的序列。
　　 2.對(duì)克隆到的基因所編碼氨基酸的進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)得到12基因

4、個(gè)可能屬于Pht1家族,分別命名為BRAdi；Pht1；1-BRAdi；Pht1;12,對(duì)這些蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析,都具有Pht1家族的典型結(jié)構(gòu),進(jìn)一步確定其屬于Pht1家族成員。
　　 3.對(duì)短柄草Pht1家族成員氨基酸序列進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)12個(gè)基因之間有很高的相似性,都具有Pht1基因家族的特征序列GGDYPLSATIMSEYA,與水稻、大麥、擬南芥中的Pht1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,進(jìn)化樹分析將這12個(gè)同源基因分為不同

5、的亞組,這些同源基因與大麥的同源性較高,其次是水稻,而與擬南芥的同源性最低。
　　 4.利用熒光定量PCR方法對(duì)Pht1家族基因進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析,這些基因在不同的組織中表達(dá)量不同,大部分基因在種子中的表達(dá)量最高,其中BdPht1；6、BdPht1；8、BdPht1；9和BdPht1；12等4個(gè)基因在苗期根中的表達(dá)顯著高于葉片。用不同磷濃度的營(yíng)養(yǎng)液處理短柄草,取根部材料,對(duì)Pht1家族基因進(jìn)行熒光定量PCR,BdPht1；6