重組野蠶絲素含RGD肽段的制備與表征.pdf

1、絲素是由蠶合成與分泌的天然蛋白質(zhì)，包括家蠶絲素和野蠶（柞蠶、天蠶、蓖麻蠶、栗蠶、樟蠶和大山蠶等）絲素。目前對(duì)絲素蛋白的研究主要集中在家蠶絲素蛋白方面，大量的研究表明家蠶絲素蛋白材料能支持多種細(xì)胞的粘附、增殖或分化，適合用作生物材料。而柞蠶絲素和天蠶絲素蛋白的氨基酸組成中分布著較多的促細(xì)胞黏附的RGD短肽（細(xì)胞特異性粘附識(shí)別信號(hào)）序列，用作細(xì)胞外基質(zhì)材料，應(yīng)能提供更良好的細(xì)胞作用界面。為了系統(tǒng)地研究野蠶絲素蛋白序列-結(jié)構(gòu)-功能間的關(guān)系，尤

2、其是揭示野蠶絲素蛋白中與細(xì)胞功能密切關(guān)聯(lián)的序列結(jié)構(gòu)，我們對(duì)天蠶（柞蠶）絲素蛋白序列特征進(jìn)行梳理，從基因水平上進(jìn)行分子設(shè)計(jì)、采用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)各種設(shè)計(jì)的基序或基序組合來(lái)加以研究。本文主要完成了一段含RGD肽段的重組表達(dá)，主要包括以下工作：
　　1、設(shè)計(jì)了編碼來(lái)自天蠶(柞蠶)絲素蛋白GSGAGGRGDGGYGSGSS即(-RGD-)1序列的基因AY1，采用基因重組技術(shù)克隆加倍至24倍的基因延伸片段AY24，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳及DNA

3、測(cè)序了驗(yàn)證構(gòu)建的基因是正確的。
　　2、將AY1及各加倍基因插入pcDNA3.1B、pET-30a(+)及pGEX-KG三種系列的表達(dá)載體，分別在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。采用瓊脂糖凝膠電泳和DNA測(cè)序鑒定了各個(gè)表達(dá)載體構(gòu)建的正確性。經(jīng)篩選后確定pGEX-KG表達(dá)載體用來(lái)表達(dá)含RGD重組蛋白，通過(guò)SDS-PAGE電泳及Western blotting驗(yàn)證了重組蛋白在大腸桿菌中成功獲得了表達(dá)。
　　3、探討了pGE

4、X-AY12和pGEX-AY24兩種表達(dá)載體分別表達(dá)的兩種融合蛋白GST-(-RGD-)12和GST-(-RGD-)24的最佳表達(dá)條件。采用親和層析柱純化得到了純度很高的兩種融合蛋白。通過(guò)SDS-PAGE電泳和Western blotting定性檢測(cè)表明：轉(zhuǎn)入pGEX-AY12的大腸桿菌在誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.5mmol/L下誘導(dǎo)6小時(shí)，融合蛋白GST-(-RGD-)12表達(dá)量達(dá)到最大值；轉(zhuǎn)入pGEX-AY24的大腸桿菌在誘導(dǎo)劑IPT

5、G濃度為1.0mmol/L，誘導(dǎo)6小時(shí)，融合蛋白GST-(-RGD-)24表達(dá)量達(dá)到最大值。進(jìn)一步定量測(cè)定得：每升菌液可獲得GST-(-RGD-)12融合蛋白45mg左右；每升菌液可獲得GST-(-RGD-)24融合蛋白28mg左右。
　　4、采用Thrombin蛋白酶酶切融合蛋白GST-(-RGD-)12和 GST-(-RGD-)24獲得目的肽段(-RGD-)12和(-RGD-)24。通過(guò)Zeta電位測(cè)量與雙向電泳分析了目的肽段