含MMP酶切位點(diǎn)的重組絲素重鏈的初步研究.pdf

1、利用腫瘤組織過量產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)以及家蠶絲素可以用于藥物載體的特性，本實(shí)驗(yàn)將MMP酶切位點(diǎn)插入重組的絲素重鏈基因中，構(gòu)建新的質(zhì)粒，并在原核細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)，在原核表達(dá)的基礎(chǔ)上對含有基質(zhì)金屬蛋白酶酶切位點(diǎn)的重組重鏈絲素作為藥物載體的可行性進(jìn)行了初步研究。
　　 PiggyBac轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)作為高效的昆蟲轉(zhuǎn)基因載體在昆蟲轉(zhuǎn)基因操作方面被大量運(yùn)用。本實(shí)驗(yàn)利用PiggyBac載體，通過顯微注射技術(shù)，將重組絲素重鏈基因?qū)爰倚Q

2、基因組，進(jìn)而產(chǎn)生帶有重組絲素重鏈基因的家蠶新品種。經(jīng)基因工程改造的家蠶產(chǎn)生的絲素蛋白將來可以用于藥物載體等醫(yī)用新材料的研究。
　　 結(jié)論:
　　 1、以菁松基因組的DNA為模板，通過設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增、連接等方法，獲得重組絲素重鏈基因，進(jìn)而成功構(gòu)建了四種原核表達(dá)質(zhì)粒、四種真核表達(dá)質(zhì)粒和四種PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體;
　　 2、利用BL21細(xì)菌表達(dá)了構(gòu)建的pGEX系列原核表達(dá)載體上攜帶的重組基因，通過SDS-P

3、AGE檢測到蛋白已經(jīng)表達(dá)，并對四種蛋白的可溶性作了分析，確定合適的誘導(dǎo)表達(dá)條件:BFib H-site和BFib H-GS-site表達(dá)的合適條件為IPTG0.6mM，溫度為27℃，培養(yǎng)時間為15h; BFib H-site-EGFP和BFibH-GS-site-EGFP表達(dá)的合適條件為IPTG0.3mM，溫度為16℃，培養(yǎng)時間為20h;
　　 3、利用GST beads對表達(dá)的蛋白BFib H-GS-site-EGFP進(jìn)行純化

4、，Western Blot檢測到蛋白已經(jīng)表達(dá);同時對表達(dá)的蛋白可酶切條件進(jìn)行了摸索，初步確定了實(shí)驗(yàn)所需的酶切體系:2.5mM substrate peptide4μl、5×Assay Buffer-2(50mMTris-HCl;750mM NaCl;25mM CaCl2;5μM ZnCl2;0.05％ Brij-35; PH7.6)20μl、0.1μg/μl MMP-21μl和純凈水75μl，37℃水浴2.5h;
　　 4、利用