RNA聚合酶I介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的TBSV病毒表達(dá)載體研究.pdf

1、植物RNA病毒載體表達(dá)系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的一類以植物作為反應(yīng)器的新型表達(dá)系統(tǒng)?，F(xiàn)有的植物RNA病毒表達(dá)載體多采用RNA聚合酶Ⅱ識(shí)別的啟動(dòng)子（Ⅱ類啟動(dòng)子）。番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）在生物安全性、外源基因承載能力和表達(dá)高效性上都具有其他植物RNA病毒無法比擬的潛在優(yōu)勢(shì)。該病毒本身無帽子結(jié)構(gòu)、多聚A尾和內(nèi)含子，將病毒載體置于RNA PolⅠ識(shí)別啟動(dòng)子（Ⅰ類啟動(dòng)子）下游，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物更“像”野生型的

2、病毒，從而能有效地提高病毒侵染性。另外，RNA聚合酶Ⅰ識(shí)別的啟動(dòng)子還具有種屬特異性，也有利于提高病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的生物安全性。
　　 本研究對(duì)RNA PolⅠ介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的TBSV病毒表達(dá)載體進(jìn)行了初步探索:克隆獲得含植物RNA聚合酶Ⅰ啟動(dòng)子核心序列的514 bp本氏煙Ⅰ型啟動(dòng)子DNA序列，通過多重序列比對(duì)，預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于保守核心序列中的第三個(gè)A處。構(gòu)建了本氏煙Ⅰ型啟動(dòng)子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的TBSV病毒表達(dá)載體QW，通過農(nóng)桿菌滲濾技術(shù)

3、將其接種寄主植物本氏煙。5'-RACE技術(shù)分別測(cè)定了本氏煙Ⅰ型啟動(dòng)子和CaMV35S啟動(dòng)子（Ⅱ型啟動(dòng)子）介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的TBSV病毒5'末端第一位堿基，結(jié)果表明，經(jīng)兩類啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄均可在體內(nèi)獲得完整5'末端的病毒基因組RNA且進(jìn)一步驗(yàn)證了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果。整株、細(xì)胞和分子水平（蛋白質(zhì)和RNA）三個(gè)層次的研究表明，本氏煙Ⅰ型啟動(dòng)子介導(dǎo)TBSV病毒載體的表達(dá)效率高于Ⅱ型啟動(dòng)子（CaMV35S啟動(dòng)子）介導(dǎo)的TBSV病毒載體。共接種RNA沉默抑制子（

4、RNA Silencing Supressors，RSSs）2b的研究結(jié)果表明，共接種RSSs以提高植物RNA病毒載體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)效率的策略，不僅適用于Ⅱ型啟動(dòng)子介導(dǎo)的病毒載體表達(dá)系統(tǒng)，同時(shí)也適用于Ⅰ型啟動(dòng)子介導(dǎo)的病毒載體表達(dá)系統(tǒng)。推測(cè)，Ⅰ啟動(dòng)子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體表達(dá)效率的提高與回避病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing，ViGS)途徑無關(guān)。Ⅰ型啟動(dòng)子對(duì)病毒載體完整性的保持和轉(zhuǎn)錄的高效性可能是載體表