SARS冠狀病毒RNA依賴的RNA聚合酶原核和真核表達(dá)及純化.pdf

1、2002年11月至2003年6月，在全球20多個(gè)國(guó)家和地區(qū)爆發(fā)的嚴(yán)重的急性呼吸道綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)是由一種新型的冠狀病毒(coronavirus，CoV)引起的。SARS病毒是全基因組由29，727個(gè)核苷酸組成，具有11個(gè)開(kāi)放閱讀框，基因組結(jié)構(gòu)與其它冠狀病毒相似，基因序列與原先發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒的同源性不高，被列為冠狀病毒科的新類型。其編碼的蛋白質(zhì)推測(cè)有23種，但對(duì)感染患病

2、起重要作用的可能是5種關(guān)鍵蛋白：E蛋白、S蛋白、M蛋白、N蛋白、蛋白酶復(fù)合體，蛋白酶復(fù)合體分成14個(gè)蛋白，其中包括RNA依賴的RNA聚合酶(RNA Dependent RNA Polymerase，RDRP)。 SARS病毒的蛋白酶復(fù)合體編碼區(qū)占基因組序列長(zhǎng)度的2/3，相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在翻譯時(shí)利用特有的核糖體移框(ribosomal frame shifting)機(jī)制產(chǎn)生兩個(gè)大小不同的ORF1ab和ORF1b編碼框編碼木瓜水解蛋

3、白酶(papain—like proteinase，PLPpro)和3C樣胰凝乳酶(3C—like proteinase，3CLpro)，二者可自身水解消化成16個(gè)成熟的復(fù)制酶蛋白(亦非結(jié)構(gòu)蛋白，nonstructural protein，nsp)。通過(guò)一系列生物信息學(xué)BLAST比對(duì)，在此16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白中發(fā)現(xiàn)RNA依賴性聚合酶(RDRP，nsp12)存在高度保守的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域，并且?guī)缀跛械恼淩NA病毒都編碼有RNA依賴的RNA聚合酶

4、，其中GDD基序高度保守的，可能與酶的催化功能相關(guān)。冠狀病毒復(fù)制酶蛋白的合成是病毒在細(xì)胞中生命活動(dòng)的開(kāi)始，復(fù)制酶蛋白復(fù)合體及其水解產(chǎn)物對(duì)于病毒基因組的復(fù)制、亞基因組的轉(zhuǎn)錄以及翻譯后的調(diào)節(jié)起到重要作用，而目前這種分子機(jī)制仍不清晰。 本課題包括的研究?jī)?nèi)容有：1)首先利用兩對(duì)引物從SARS—CoV cDNA擴(kuò)增出RDRP基因的全長(zhǎng)，分別克隆入真核表達(dá)載體pCMV—Myc和原核表達(dá)載體pGEX4T—1。2)真核表達(dá)RDRP蛋白并研究其細(xì)

5、胞定位。3)原核誘導(dǎo)GST—RDRP融合蛋白，并純化此蛋白，為了進(jìn)一步研究RDRP蛋白的功能做準(zhǔn)備。4)利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)將GDD突變?yōu)锳DD，即將甘氨酸突變?yōu)楸彼?，并?gòu)建突變ADD的真核和原核表達(dá)載體pCMV—Myc—M-Pol and pGEX—4T—1—M-Pol。5)原核誘導(dǎo)突變型GST—RDRP融合蛋白，并純化此蛋白，為下一步比較野生型和突變型GST—RDRP體外合成RNA的功能作準(zhǔn)備。 本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)pCMV—

6、Myc-Pol轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，用Western—blot方法檢測(cè)到其成功表達(dá)，并在共聚焦顯微鏡下觀察蛋白在293細(xì)胞的定位；通過(guò)構(gòu)建pGEX4T—1-Pol和pGEX4T—1—M-Pol，在大腸桿菌中成功地誘導(dǎo)了帶有GST標(biāo)簽的野生型和突變型重組蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)后純化得到野生型和突變型GST—RDRP重組蛋白。 結(jié)論：成功構(gòu)建的真核表達(dá)載體，在真核細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的RDRP蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)。成功構(gòu)建表達(dá)突變型和野生型RDRP融合蛋