棉花RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（GhRdRP）基因的分離及功能分析.pdf

1、植物中RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)早在上世紀(jì)七十年代首次在中國(guó)大白菜中發(fā)現(xiàn)，隨后又陸續(xù)在花椰菜、煙草、番茄、豇豆、黃瓜、水稻、大麥、玉米等植物中發(fā)現(xiàn)。RdRP以細(xì)胞或病毒RNA為模板合成短的cRNA，參與序列特異性的dsRNA誘導(dǎo)的RNA沉默及抗病毒防御途徑，目前已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本文以經(jīng)濟(jì)作物棉花(Gossypium hirsutum)為實(shí)驗(yàn)材料，首次從棉花中克隆

2、得到RdRP基因(GhRdRP)，并對(duì)其進(jìn)行了序列比對(duì)，表達(dá)特性分析及初步功能鑒定，為進(jìn)一步研究該基因的功能及作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1、利用同源序列設(shè)計(jì)兼并引物，通過(guò)RT-PCR和RACE-PCR的方法從棉花中克隆得到一個(gè)RdRP基因，命名為GhRdRP。GenBank注冊(cè)號(hào)為DQ445607，其全長(zhǎng)3672 bp，編碼一個(gè)1110氨基酸的蛋白質(zhì)。序列分析發(fā)現(xiàn)，GhRdRP具有RdRP的功能保守區(qū)，該保守區(qū)內(nèi)存

3、在典型保守基序DbDGD(b代表任一殘基)，是二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合并產(chǎn)生催化活性的位點(diǎn)。GhRdRP同來(lái)源于擬南芥、煙草、番茄、大麥中的幾種RdRP具有較高同源性，同源性高達(dá)59.29-66.37％；同酵母、粗糙脈胞菌及線(xiàn)蟲(chóng)中的RdRP也具有一定的同源性。cDNA序列與基因組序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)GhRdRP基因組序列內(nèi)存在四個(gè)內(nèi)含子，其中一個(gè)內(nèi)含子位于5'UTR內(nèi)。Southern雜交結(jié)果表明GhRdRP在棉花基因組中是以單拷貝的形式存在的。

4、 2、通過(guò)反向PCR方法我們獲得了954 bp的目的基因啟動(dòng)子序列，經(jīng)軟件分析發(fā)現(xiàn)：該區(qū)域中存在SA、ABA、MeJA、生長(zhǎng)素等響應(yīng)元件，ACE、Box4、BoxI、G-box、I-Box等一些光誘導(dǎo)有關(guān)的元件，還有兩個(gè)HSE熱響應(yīng)元件。半定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)，GhRdRP轉(zhuǎn)錄水平受SA(salicylicacid)和5-ssal(5-Sulfo-salicylic acid)的誘導(dǎo)而提高；棉花幼苗接種棉花立枯絲核菌(Rhizocto

5、nia solani Kuhn)后，GhRdRP表達(dá)量也有明顯提高，可以推測(cè)GhRdRP參與了病原侵染反應(yīng)過(guò)程。 3、將GhRdRP構(gòu)建了正義植物表達(dá)載體pBI121-GhRdRP，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化煙草(NC89)，同時(shí)轉(zhuǎn)空載體為對(duì)照。經(jīng)卡那霉素篩選獲得若干再生植株。經(jīng)過(guò)PCR鑒定及半定量RT-PCR分析，結(jié)果證明GhRdRP在轉(zhuǎn)基因煙草中得到成功表達(dá)。 4、選取兩個(gè)To代轉(zhuǎn)基因株系的自交種子擴(kuò)繁，得到T1代轉(zhuǎn)

6、基因植株。在分子鑒定基礎(chǔ)上，初步證明所測(cè)試的正義轉(zhuǎn)基因株系在T1代中的遺傳基本符合3:1的分離規(guī)律?？共《緦?shí)驗(yàn)中，分別接種煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)7天后結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)TMV的抗病能力明顯高于對(duì)照植株，而對(duì)CMV、PVY沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抗病性。 5、從GhRdR