番茄葉片GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因（GMPase）的cDNA克隆及功能分析.pdf

1、維生素C又稱抗壞血酸(AsA)，是一種普遍存在于植物組織的高豐度小分子抗氧化物質(zhì)(Asada and Takahashi，1987)，在植物抵抗氧化脅迫中具有重要作用，它可以與單線態(tài)氧(O<,2><'1>)、超氧自由基(O<,2><'->)、過氧化氫(H<,2>O<,2>)和羥自由基(HO<'->)等活性氧反應(yīng)，保持維生素E的還原狀態(tài)(Asada，1994)，并可做為抗壞血酸過氧化物酶的底物(Conklinet al．，1996，199

2、7；Noctor and Foyer，1998；Sminloff，2000；Sanmartin et al．，2003)。植物中AsA的重要性不僅在于它在植物抵抗氧化脅迫中具有重要作用，而且近年來的研究發(fā)現(xiàn)，AsA對于光合作用和光保護(hù)、細(xì)胞的生長和分裂以及一些重要次生代謝物和乙烯的合成等諸多方面起著非常重要的生理功能。 GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPase)是植物AsA生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，其催化所得產(chǎn)物GDP-甘露糖也

3、用于細(xì)胞壁碳水化合物的合成和蛋白糖基化。GMPase對提高植物體內(nèi)AsA含量，增強(qiáng)植物的抗脅迫能力具有非常重要的作用。本研究從番茄葉片中克隆到GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因，研究了在溫度逆境下該基因在番茄各器官中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，然后將構(gòu)建的該基因正義和反義表達(dá)載體用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草植株和馬鈴薯植株中，研究其在煙草和馬鈴薯體內(nèi)的功能及表達(dá)，并進(jìn)一步研究了轉(zhuǎn)反義基因煙草抗壞血酸含量和在高溫和低溫度逆境下抗氧化系統(tǒng)的變化，主要結(jié)果如下：

4、 1．利用同源序列設(shè)計(jì)簡并引物，通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的中間片段，再通過5’-RACE和3’-RACE分別克隆到5’片段和3’片段，拼接后設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增到全長1402 bp cDNA，ORF為1083 bp，編碼361個(gè)氨基酸的多肽，分子量約為43 kDa。同源序列比較發(fā)現(xiàn)，番茄GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因序列與馬鈴薯、煙草、紫花苜蓿、擬南芥的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的序列高度同源，

5、因此推斷我們獲得的全長cDNA．編碼的產(chǎn)物是GDP-甘露糖焦磷酸化酶，該基因命名為GMPase。聚類分析也表明GMPase與馬鈴薯、煙草、紫花苜蓿、擬南芥的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的親緣關(guān)系很近。 2．Northern 雜交結(jié)果表明，GMPase基因在番茄不同器官中呈非特異性表達(dá)，以葉片中表達(dá)水平最高，其次為果實(shí)，莖、根中表達(dá)量最少。其表達(dá)水平在48h內(nèi)隨溫度脅迫處理時(shí)間的延長而增加，但3h時(shí)其表達(dá)較低，說明GMPase的表

6、達(dá)受溫度脅迫誘導(dǎo)。 3．將獲得的GMPase基因與含有35S啟動(dòng)子的pBI121載體重組，分別構(gòu)建了正義和反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，用PCR及Northern雜交的方法對帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)一步檢測，結(jié)果證明成功地獲得了轉(zhuǎn)正義和反義基因的煙草植株及轉(zhuǎn)正義基因的馬鈴薯植株。 4．在轉(zhuǎn)反義GMPase基因煙草中抑制了GMPase基因的表達(dá)，GMPase特異探針標(biāo)記的Northern雜交結(jié)果表明GM

7、Pase基因在轉(zhuǎn)反義GMPase基因煙草中在常溫和溫度脅迫條件下均不表達(dá)，而野生煙草中GMPase基因表達(dá)水平在48小時(shí)內(nèi)隨溫度脅迫處理時(shí)間的延長而增加，但3h時(shí)其表達(dá)較低，結(jié)果與野生番茄相同。 5．構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-GMPase，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)融合蛋白，將強(qiáng)誘導(dǎo)帶切下，溶于PBS獲得抗原，免疫小白鼠，其抗血清效價(jià)為 1∶500。Western雜交表明，轉(zhuǎn)正義煙草植株中GMPase基因已在蛋白水平過量表達(dá)，轉(zhuǎn)

8、反義煙草植株中GMPase基因表達(dá)被抑制。 6．與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)反義煙草葉片抗壞血酸含量降低30％-40％，表現(xiàn)出與野生煙草不同的表型。轉(zhuǎn)反義基因植株在組織培養(yǎng)過程就開始開花，且所有轉(zhuǎn)反義基因植株在7—8片葉時(shí)均開始開花，而野生煙草沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象，當(dāng)其生長至 25-28葉時(shí)才開始開花，轉(zhuǎn)反義GMPase基因煙草開花時(shí)間比野生煙草提前近2個(gè)月。此外，在7-8葉時(shí)，轉(zhuǎn)反義基因煙草的節(jié)間顯著長于野生煙草且葉片較薄、較小，并出現(xiàn)早

9、衰的現(xiàn)象。 7．GMPase基因的抑制表達(dá)明顯降低了轉(zhuǎn)反義基因煙草的抗氧化能力，具體表現(xiàn)為在低溫(4℃)和高溫(40℃)脅迫下，轉(zhuǎn)反義GMPase基因煙草葉片的SOD、APX和CAT活性明顯低于野生煙草，而其葉片MDA和H<,2>O<,2>含量則正好相反，大大高于野生煙草。 8．上述研究結(jié)果充分證明了GMPase基因在植物抗壞血酸生物合成中的關(guān)鍵作用。盡管GMPase并非清除活性氧的抗氧化酶，但是GMPase基因的表達(dá)卻