ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因的玉米遺傳轉(zhuǎn)化與分子鑒定.pdf

1、玉米是世界上最重要的糧食、飼料以及經(jīng)濟(jì)兼?zhèn)涞淖魑?。玉米淀粉是重要的植物產(chǎn)品之一，是玉米的主要組成成分，主要存在于玉米種子的胚乳中。食品和化工行業(yè)的主要原材料是以淀粉為主，其中超過2500種工業(yè)深加工產(chǎn)品以玉米淀粉為主要原材料。因此，玉米中的淀粉含量的提高，對于增加工業(yè)制品的原材料，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會價值。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶在谷物種子淀粉的生化合成過程中，發(fā)揮著調(diào)節(jié)淀粉合成的關(guān)鍵角色，在玉米胚乳中淀粉合成的相關(guān)酶中，AGPase是

2、主要的限速酶。對AGPase基因人工修飾改造后，可以提高AGPase亞基間相互作用，增強酶的熱穩(wěn)定性，提高AGPase的活性，減弱對Pi抑制的敏感性，增加對3-PGA的激活敏感性，促進(jìn)淀粉合成，增加玉米胚乳中淀粉的含量，進(jìn)而增加玉米的產(chǎn)量。
　　本研究將人工修飾改造過的Sh2基因和BTTP-Sh2基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，將構(gòu)建好原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，并進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)。對誘導(dǎo)產(chǎn)物分析

3、得出，Sh2基因在大腸桿菌中得到高效的表達(dá)，BTTP-Sh2基因也在大腸桿菌中得到了表達(dá)，但是蛋白表達(dá)量較少。
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化玉米，獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株比較困難，因為玉米不是農(nóng)桿菌的天然寄主，對其侵染不具有敏感性。基因槍的出現(xiàn)，為基因的轉(zhuǎn)化提供了快速有效的方法。本研究進(jìn)而將人工修飾改造過的AGPase基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA3300中，利用玉米27kDazein基因的啟動子驅(qū)動AGPase基因表達(dá)，另外選擇

4、Bar基因作為選擇標(biāo)記基因。利用基因槍轟擊法將該基因?qū)胗衩纂s交組合HiⅡ A×B和HiⅡ B愈傷組織中，通過除草劑雙丙氨膦抗性篩選，篩選出抗性愈傷組織，通過對抗性愈傷bar免疫試紙條檢測以及PCR擴(kuò)增檢測，篩選出抗性愈傷?？剐杂鷤M織經(jīng)過再生培養(yǎng)，獲得含有AGPase基因的轉(zhuǎn)基因玉米植株。
　　通過分子生物學(xué)檢測試驗研究初步斷定修飾過的Sh2基因和BTTP-Sh2基因已經(jīng)成功整合到玉米的基因組中，Sh2基因和BTTP-Sh2基因