甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、甘薯是全球第六大作物，薯抗災(zāi)力強，耐旱，耐瘠薄，丘陵山區(qū)也能種植，在作物較難生長的地方，甘薯也能獲得較好的產(chǎn)量。甘薯因塊根富含淀粉既能用做食物又能作為工業(yè)原料而廣泛的被種植。這些特性吸引了越來越多研究者深入到了甘薯這個領(lǐng)域。
　　 淀粉是植物通過光合作用產(chǎn)生的一種多糖高分子化合物，淀粉生物合成過程中存在四種關(guān)鍵酶，即：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGpase)、淀粉合成酶

2、(starch synthase，)，分支酶(branching enzyme，)及去分支酶(de-branching enzyme，)。在AGPase的作用下，葡萄糖-1-磷酸(Glu-1-P)與ATP作用生成ADP-葡萄糖(ADP-Glu)，隨后ADP-Glu在SS的作用下進行鏈的延伸。當鏈達到一定長度后，在SBE作用下于線性鏈之間引入a-1，6-糖苷鍵形成分枝，并進一步在SS催化下延長分枝,DBE對分枝進行修飾，最后合成具有一定結(jié)

3、構(gòu)特性的淀粉結(jié)晶體。AGPaSe催化淀粉合成的第一步，是淀粉合成過程中的限速酶，其活性的改變將直接影響著淀粉的合成速率，直接決定貯藏組織中淀粉的水平，從而最終決定了植物的產(chǎn)量。
　　 AGP為四聚體，ibAGPase有α、β兩種亞基，其中小亞基α的兩個編碼基因為ibAGPa1和ibAGPa2。兩個α亞基在物種中非常保守，是酶的催化中心；編碼IbAGPase大亞基β亞基的基因，目前有ibAGPb1A，ibAGPb1B，ibAGPb

4、2，ibAGPb3共計四個。β亞基是酶活性調(diào)節(jié)中心，可能與識別、Glu結(jié)合、調(diào)控有關(guān)，物種間的保守性比小亞基α的低。AGP合成酶兩種亞基的基本氨基酸序列不同，大亞基主要起調(diào)控作用，而小亞基與底物結(jié)合，起催化作用。
　　 本研究以總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用特異引物PCR擴增出了甘薯AGPase基因兩小亞基的序列，分析表明a1亞基與a2亞基氨基酸同源性達90％以上。AGPa1蛋白和AGPa2蛋白預(yù)測相對分子量分別為57.10

5、9KD和57.113KD，等電點為7.23和7.89。
　　 利用表達載體PCAMBIA1301，在其多克隆位點插入了含35S啟動子和NOS的表達框，分別用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切PCAMBIA1301-35s，HindⅢ/EcoRI雙酶切pCambia1301-35S-Nos，檢測35S和NOS的插入情況，再將2個目的基因分別插入其中，構(gòu)建了PCAMBIA1301-35s-AGPaseal-NOS PCAMBIA1301-3

6、5s-AGPase a2-NOS兩個表達載體，分別用XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切1301-Al載體，XbaⅠ和sacⅠ雙酶切1301-A2載體進行檢測。
　　 浸染的5個甘薯品種經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)，浸染，共培養(yǎng)后，在篩選培養(yǎng)基上1個多月左右，在一些莖段的切口處肉眼可以看到長出了芽：生長比較緩慢，到2個月多月的時候能長到5CM左右，將其切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。有些側(cè)芽在生根培養(yǎng)基上逐漸的被抗生素篩死。被侵染的葉柄、葉片少數(shù)有少量的愈傷出現(xiàn)，但不分