PCR增效劑對(duì)體外長(zhǎng)基因片段合成效率影響的研究.pdf

1、后基因組時(shí)代,基于全基因組序列的研究越來(lái)越多,這就要求研究者們能夠在短時(shí)間內(nèi)以最高的效率獲得某一樣品的全基因組序列。就技術(shù)而言,目前全基因組序列的體外獲得主要是通過(guò)DNA體外拼接的方式完成,但大多數(shù)體外拼接方法都存在拼接長(zhǎng)度有限、拼接效率低、步驟繁瑣和成本高等缺點(diǎn),本課題中采用的重疊延伸PCR和Gibson等溫一步拼接法就是兩種典型的DNA體外拼接技術(shù),然而重疊延伸PCR拼接技術(shù)的應(yīng)用受限于其拼接長(zhǎng)度,而Gibson等溫一步拼接法拼接片

2、段長(zhǎng)度雖然可以達(dá)到幾百kb,但是其成本卻很高,且拼接效率很低。近年來(lái)的一些研究成果表明納米材料和核內(nèi)小分子可以通過(guò)與DNA片段或DNA聚合酶相互作用,或者降低目的產(chǎn)物的Tm值等機(jī)制對(duì)DNA片段的PCR擴(kuò)增起到增效作用,受這些研究的啟發(fā),本課題將這些新型的PCR添加劑應(yīng)用于重疊延伸PCR拼接法和Gibson等溫一步拼接法中,從而對(duì)兩種拼接方法的拼接長(zhǎng)度和拼接效率進(jìn)行了改善。
　　本課題主要進(jìn)行了四個(gè)方面的研究工作:含有重疊序列的短D

3、NA片段的獲得;小分子對(duì)重疊延伸PCR拼接效率影響效率的研究及增效小分子的篩選;小分子對(duì)Gibson Assembly拼接效率影響的研究及增效小分子的篩選;增效小分子增效機(jī)制的研究。
　　含有重疊序列的短DNA片段的獲得主要是通過(guò)設(shè)計(jì)接頭引物,并借助PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行。本課題共設(shè)計(jì)了15對(duì)接頭引物,利用這些接頭引物擴(kuò)增獲得的短DNA片段之間可人為添加上一段overlaps,overlaps有40bp、80bp和202bp三種長(zhǎng)度

4、。這些短DNA片段進(jìn)行拼接可獲得長(zhǎng)達(dá)6kb、10kb和27kb的長(zhǎng)及超長(zhǎng)DNA片段。
　　小分子對(duì)重疊延伸PCR和Gibson Assembly拼接效率影響的研究及增效小分子的篩選,則首先通過(guò)測(cè)試小分子的使用濃度、反應(yīng)條件、檢測(cè)方法等實(shí)驗(yàn)參數(shù)建立了兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?然后將小分子添加在拼接體系中,通過(guò)觀察各組的拼接效率判斷各種小分子對(duì)兩種拼接方法拼接效率的影響,從而篩選出了具有增效作用的小分子。最終篩選出了一種對(duì)GibsonAssemb

5、ly具有增效作用的核內(nèi)小分子,是23號(hào)肌苷;三種對(duì)重疊延伸PCR具有增效作用的核內(nèi)小分子,分別為23號(hào)肌苷、29號(hào)異亮氨酸和32號(hào)纈氨酸;得到四種對(duì)重疊延伸PCR有增效作用的納米材料,分別為18號(hào)羧基化短雙壁碳納米管、39號(hào)短多壁納米碳管、48號(hào)羥基化的短多壁納米碳管和53號(hào)羧基化短多壁碳納米管。
　　對(duì)于小分子增效機(jī)制的研究主要通過(guò)Q-PCR的方法進(jìn)行測(cè)試。經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)小分子可以顯著提高DNA擴(kuò)增的特異性,并將基因片段的Tm值