人血清白蛋白—人粒細(xì)胞集落刺激因子(Ⅰ)融合蛋白的表達(dá)與純化及GMP生產(chǎn).pdf

1、人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)在腫瘤放療、化療引起的粒細(xì)胞減少癥、再生障礙性貧血、放射病等血液病的治療及骨髓移植方面具有重要作用，現(xiàn)已應(yīng)用于臨床，是每年銷(xiāo)售額最大的幾個(gè)生物制品藥物之一。
　　hG-CSF的最大缺陷是在血漿中半衰期較短。為了延長(zhǎng)hG-CSF半衰期，本文成功利用甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了人血清白蛋白和粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白(rHSA-G-CSF)作為長(zhǎng)效的基因工程藥物。首先用PCR方法將HSA和hG-CSF兩個(gè)

2、片段連接，再克隆到酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9中，經(jīng)酶切線性化后原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入酵母細(xì)胞進(jìn)行整合?；蚬こ叹?jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)表達(dá)、層析法分離純化得到融合蛋白。純化后的融合蛋白經(jīng)印跡分析(Western-Blot)表明同時(shí)具有HSA和G-CSF的免疫原性，且穩(wěn)定性增加，半衰期大大延長(zhǎng)，達(dá)到25～30h，是G-CSF單體血漿半衰期的15～20倍;同時(shí)體外生物學(xué)活性分析表明，經(jīng)融合修飾的G-CSF的活性仍保留有G-CSF單體的50％以上。與Amg