表達(dá)β干擾素與人血清白蛋白融合蛋白工程菌的構(gòu)建.pdf

1、β干擾素是干擾素家族中的一員，具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)作用，已經(jīng)成功地應(yīng)用于治療多種疾病。為了提高β干擾素在體內(nèi)的半衰期，構(gòu)建了IFNβ-HSA融合蛋白，將其在畢赤酵母系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)融合蛋白進(jìn)行了鑒定、活性分析和初步的純化。 從人外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA，參照數(shù)據(jù)庫中IFNβ基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，利用PCR方法，從基因組DNA中擴(kuò)增IFNβ基因，通過限制性酶切位點(diǎn)SalⅠ和HindⅢ，將其插入到克隆載體p

2、BluescriptⅡKS(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBlu2KSP-IFNβ，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示克隆得到的IFNβ基因與GeneBank數(shù)據(jù)庫中登記號(hào)為NM002176的序列完全一致。 利用重疊PCR技術(shù)，體外拼接IFNβ和HSA基因，將其插入到克隆載體pBluescriptⅡKS(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBlu2KSP-IFNβ-HSA，進(jìn)行測(cè)序，用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pBlu2KSP-IFNβ-HSA，回收IF

3、Nβ-HSA片段，將其插入到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k中，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9k-IFNβ-HSA。結(jié)果表明PCR拼接得到的IFNβ-HSA融合基因與預(yù)期的一致，構(gòu)建的表達(dá)載體pPIC9k-IFNβ-HSA經(jīng)限制性酶切分析表明，融合基因已經(jīng)成功地插入到載體pPIC9k中。 表達(dá)載體pPIC9k-IFNβ-HSA經(jīng)SalⅠ線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71，用MD平板進(jìn)行初篩，含G418的MD平板復(fù)篩，得到的重組子進(jìn)行進(jìn)一步的誘

4、導(dǎo)表達(dá)分析篩選，將表達(dá)量較高的重組畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定和抗病毒活性分析，優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度后，對(duì)融合蛋白進(jìn)行初步的分離純化。經(jīng)G418篩選得到能耐受3mg/mlG418重組菌12株，進(jìn)一步的誘導(dǎo)表達(dá)篩選得到表達(dá)量較高的4株重組菌rIH1、rIH2、rIH4和rIH8，Western雜交顯示表達(dá)的融合蛋白IFNβ-HSA具有很好的HSA抗原性，分子量約90kDa，采用WISH/VSV系統(tǒng)測(cè)定發(fā)酵液中融合蛋白活性為640IU/mL