瑞氏木霉纖維素酶降解模式及其功能多樣性研究.pdf

1、隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，化石資源迅速地被消耗，能源、資源、環(huán)境問(wèn)題已經(jīng)成為制約人類社會(huì)經(jīng)濟(jì)和生態(tài)可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸。纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，是地球上最豐富的可再生碳源。纖維素的充分利用能夠以可持續(xù)的方式緩解化石能源過(guò)度利用帶來(lái)的環(huán)境危機(jī)。但是由于纖維素生物降解的生產(chǎn)成本過(guò)高，限制了資源的有效利用。
　　為有效利用纖維素資源，構(gòu)建高效纖維素降解酶系一直為研究的重點(diǎn)。目前普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為纖維素酶系構(gòu)成應(yīng)主要由糖苷水解酶系、氧化酶

2、系及輔助降解因子等組成。相對(duì)于外切纖維素酶及β-葡萄糖苷酶較為清晰的功能定位，酶系中往往存在多種內(nèi)切纖維素酶，其功能與作用模式并沒(méi)有得到很好的區(qū)分。同時(shí)，由于纖維素酶活測(cè)定使用底物衍生物和類似物并不能夠全面反映酶系的活力，更不能確切反映纖維素酶系中各組分的角色與功能。因此，本文針對(duì)以上問(wèn)題進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，取得主要研究結(jié)果如下:
　　1、通過(guò)對(duì)瑞氏木霉在14種不同碳源上糖苷水解酶的動(dòng)態(tài)表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)瑞氏木霉纖維素酶系不同組分的表

3、達(dá)分泌具有底物差異性。說(shuō)明不同內(nèi)切纖維素酶組分具有生理功能的差異性。
　　對(duì)瑞氏木霉進(jìn)行不同碳源下的分批培養(yǎng)，測(cè)定了其胞外外切纖維素酶、內(nèi)切纖維素酶和木聚糖酶活性，并對(duì)培養(yǎng)基中還原糖的變化和寡糖的主要成分進(jìn)行了時(shí)間進(jìn)程的連續(xù)跟蹤分析。研究發(fā)現(xiàn)，高聚合度寡糖的誘導(dǎo)能力要大于單糖的誘導(dǎo)能力。在不同碳源條件下，內(nèi)切纖維素酶的分泌時(shí)間及組分種類顯示明顯的不同。這說(shuō)明瑞氏木霉會(huì)根據(jù)胞外碳源的變化調(diào)整內(nèi)切纖維素酶的分泌，印證了同一微生物分泌的

4、內(nèi)切纖維素酶應(yīng)具有不同的功能。進(jìn)一步選取三種代表性的天然碳源（秸稈+麩皮、RAC、木聚糖）條件下發(fā)酵第五天的胞外蛋白質(zhì)組進(jìn)行了胞外蛋白質(zhì)組的系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示三種碳源條件下的蛋白組成成分各不相同，相差較大。RAC主要誘導(dǎo)降解纖維素的酶類;木聚糖為碳源的條件下，主要誘導(dǎo)降解半纖維素的酶類大量分泌，降解纖維素的酶類分泌量很少。由于秸稈和麩皮成分較為復(fù)雜，因此降解所需的纖維素酶，半纖維素酶都高效分泌。同時(shí)三種碳源條件下，內(nèi)切纖維素酶表達(dá)的種類

5、及其表達(dá)量都有明顯的差別，這說(shuō)明不同內(nèi)切纖維素酶組分具有生理功能的差異性。該研究結(jié)果對(duì)于以瑞氏木霉酶系為主的高效纖維素降解酶系的復(fù)配具有指導(dǎo)意義。
　　2、建立了利用熒光輔助糖電泳(FACE)定量表征纖維素酶水解模式的方法，首次發(fā)現(xiàn)不同內(nèi)切纖維素酶組分的作用模式存在顯著差異。
　　FACE技術(shù)是一種靈敏簡(jiǎn)單并且相對(duì)高通量的糖分析技術(shù)。在本研究中，將該技術(shù)用于纖維素酶的活性分析，通過(guò)對(duì)FACE圖譜定量的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)纖維素酶水

6、解過(guò)程中產(chǎn)生的纖維寡糖種類以及每種寡糖含量的隨時(shí)間過(guò)程的檢測(cè)和定量分析，克服了常規(guī)以終點(diǎn)還原端總量反應(yīng)纖維素酶活性方法的不足。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用該FACE技術(shù)可以快速區(qū)分纖維素酶系中的外切纖維素酶(CBH)、內(nèi)切纖維素酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(BG)等酶組分的類別，實(shí)現(xiàn)了纖維素酶種類與降解模式的快速確定。通過(guò)對(duì)不同內(nèi)切纖維素酶在水解無(wú)定形纖維素（RAC）的產(chǎn)物譜的定量分析，首次確認(rèn)了不同內(nèi)切纖維素酶的作用模式存在明顯差異。即使同一糖苷水解

7、酶家族(GH5)中，不同酶組分也有不同的降解模式。這一結(jié)果對(duì)于解釋纖維素降解微生物為什么能夠產(chǎn)生多組分內(nèi)切纖維素酶提供了一個(gè)直接的證據(jù)。同時(shí)該研究結(jié)果說(shuō)明僅僅基于序列一致性對(duì)糖苷水解酶進(jìn)行分類可能是不夠的，不能充分說(shuō)明不同糖苷水解酶功能上的差別?；贔ACE技術(shù)表征不同纖維素酶降解模式的分析，可以為糖苷水解酶的功能分類，特別是內(nèi)切纖維素酶功能的進(jìn)一步分類及功能分析提供一個(gè)新的有力工具。
　　3、通過(guò)對(duì)瑞氏木霉4種內(nèi)切纖維素酶的動(dòng)態(tài)

8、寡糖產(chǎn)物譜及其對(duì)活性中心生物信息學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)不同降解模式的內(nèi)切纖維素酶有其特定的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　對(duì)瑞氏木霉的EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ、EGⅣ四種內(nèi)切纖維素酶組分水解無(wú)定形纖維素和纖維寡糖的產(chǎn)物譜進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果表明不同內(nèi)切纖維素酶組分并非傳統(tǒng)上認(rèn)為的隨機(jī)結(jié)合并切斷無(wú)定型纖維素鏈，而是與外切纖維素酶相似，特定的內(nèi)切纖維素酶具有特征性產(chǎn)物譜。通過(guò)對(duì)這些酶組分對(duì)纖維寡糖水解的比較分析，發(fā)現(xiàn)每種內(nèi)切纖維素酶的最小寡糖的結(jié)合單元是不

9、同的:EGⅠ具有強(qiáng)的結(jié)合纖維三糖并降解的能力;EGⅡ可以結(jié)合并降解纖維三糖，但能力較EGⅠ弱;EGⅢ具有結(jié)合并降解纖維四糖的能力，EGⅣ具有結(jié)合并降解纖維五糖的能力。利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析技術(shù)，對(duì)具有結(jié)晶結(jié)構(gòu)的三種內(nèi)切纖維素酶(EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ)進(jìn)行了比較分析。通過(guò)生物信息學(xué)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，三種內(nèi)切纖維素酶催化活性部位的結(jié)構(gòu)、活性中心表面電勢(shì)都有較大的差別。對(duì)內(nèi)切纖維素酶與寡糖相互作用的π-H相互作用和氫鍵進(jìn)行了分析，確定了

10、每種內(nèi)切纖維素酶與寡糖相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，并對(duì)這些氨基酸殘基的分布進(jìn)行了分析，得出了與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致的結(jié)論。這說(shuō)明同種微生物分泌的多種內(nèi)切纖維素酶具有不同的作用模式，應(yīng)有不同的生物學(xué)功能。
　　4、利用熒光光譜方法實(shí)現(xiàn)了纖維素酶與底物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)定量測(cè)定，為研究蛋白質(zhì)分子與糖分子配體之間的相互作用提供了一種可行的方法。利用該方法定量表征出以pNPC為底物檢測(cè)外切纖維素酶活性時(shí)會(huì)高估相應(yīng)催化活力。
　　纖維素酶可以特異

11、性識(shí)別并結(jié)合纖維素，其中活性中心的色氨酸等芳香族氨基酸殘基在底物識(shí)別過(guò)程起著重要作用。色氨酸殘基可以被295 nm的激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射355 nm的熒光，當(dāng)色氨酸殘基與糖分子等配體結(jié)合后會(huì)誘導(dǎo)電子軌道變化發(fā)生熒光淬滅，其淬滅強(qiáng)度與配體分子的結(jié)合量之間具有劑量效應(yīng)關(guān)系?；诖?，本研究利用熒光光譜方法對(duì)糖苷水解酶與底物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行了定量分析。通過(guò)對(duì)淬滅曲線的單點(diǎn)/多點(diǎn)結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線擬合分析，明確區(qū)分了糖苷水解酶單點(diǎn)特異性結(jié)合與多點(diǎn)非特

12、異性結(jié)合的定量關(guān)系，利用特異性結(jié)合區(qū)間定量測(cè)定了糖苷水解酶與底物結(jié)合過(guò)程動(dòng)力學(xué)常數(shù)以及其自由能變化，同時(shí)定量分析了外切纖維素酶底物類似物對(duì)硝基苯β-D纖維二糖苷(pNPC)作為外切纖維素酶活性表征底物的局限性，發(fā)現(xiàn)以pNPC為底物檢測(cè)纖維素外切酶酶活時(shí)會(huì)有過(guò)高的正向偏差?；谏彼釟埢Y(jié)合配體熒光光譜的定量分析可以準(zhǔn)確分析糖苷水解酶與底物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，有助于促進(jìn)蛋白質(zhì)與多糖相互作用的深入研究，可為研究蛋白質(zhì)分子與小分子配體之間的相互