瑞氏木霉纖維素酶降解模式及其功能多樣性研究.pdf

1、隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，化石資源迅速地被消耗，能源、資源、環(huán)境問題已經(jīng)成為制約人類社會經(jīng)濟(jì)和生態(tài)可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸。纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，是地球上最豐富的可再生碳源。纖維素的充分利用能夠以可持續(xù)的方式緩解化石能源過度利用帶來的環(huán)境危機(jī)。但是由于纖維素生物降解的生產(chǎn)成本過高，限制了資源的有效利用。
　　為有效利用纖維素資源，構(gòu)建高效纖維素降解酶系一直為研究的重點(diǎn)。目前普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為纖維素酶系構(gòu)成應(yīng)主要由糖苷水解酶系、氧化酶

2、系及輔助降解因子等組成。相對于外切纖維素酶及β-葡萄糖苷酶較為清晰的功能定位，酶系中往往存在多種內(nèi)切纖維素酶，其功能與作用模式并沒有得到很好的區(qū)分。同時，由于纖維素酶活測定使用底物衍生物和類似物并不能夠全面反映酶系的活力，更不能確切反映纖維素酶系中各組分的角色與功能。因此，本文針對以上問題進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，取得主要研究結(jié)果如下:
　　1、通過對瑞氏木霉在14種不同碳源上糖苷水解酶的動態(tài)表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)瑞氏木霉纖維素酶系不同組分的表

3、達(dá)分泌具有底物差異性。說明不同內(nèi)切纖維素酶組分具有生理功能的差異性。
　　對瑞氏木霉進(jìn)行不同碳源下的分批培養(yǎng)，測定了其胞外外切纖維素酶、內(nèi)切纖維素酶和木聚糖酶活性，并對培養(yǎng)基中還原糖的變化和寡糖的主要成分進(jìn)行了時間進(jìn)程的連續(xù)跟蹤分析。研究發(fā)現(xiàn)，高聚合度寡糖的誘導(dǎo)能力要大于單糖的誘導(dǎo)能力。在不同碳源條件下，內(nèi)切纖維素酶的分泌時間及組分種類顯示明顯的不同。這說明瑞氏木霉會根據(jù)胞外碳源的變化調(diào)整內(nèi)切纖維素酶的分泌，印證了同一微生物分泌的

4、內(nèi)切纖維素酶應(yīng)具有不同的功能。進(jìn)一步選取三種代表性的天然碳源（秸稈+麩皮、RAC、木聚糖）條件下發(fā)酵第五天的胞外蛋白質(zhì)組進(jìn)行了胞外蛋白質(zhì)組的系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示三種碳源條件下的蛋白組成成分各不相同，相差較大。RAC主要誘導(dǎo)降解纖維素的酶類;木聚糖為碳源的條件下，主要誘導(dǎo)降解半纖維素的酶類大量分泌，降解纖維素的酶類分泌量很少。由于秸稈和麩皮成分較為復(fù)雜，因此降解所需的纖維素酶，半纖維素酶都高效分泌。同時三種碳源條件下，內(nèi)切纖維素酶表達(dá)的種類

5、及其表達(dá)量都有明顯的差別，這說明不同內(nèi)切纖維素酶組分具有生理功能的差異性。該研究結(jié)果對于以瑞氏木霉酶系為主的高效纖維素降解酶系的復(fù)配具有指導(dǎo)意義。
　　2、建立了利用熒光輔助糖電泳(FACE)定量表征纖維素酶水解模式的方法，首次發(fā)現(xiàn)不同內(nèi)切纖維素酶組分的作用模式存在顯著差異。
　　FACE技術(shù)是一種靈敏簡單并且相對高通量的糖分析技術(shù)。在本研究中，將該技術(shù)用于纖維素酶的活性分析，通過對FACE圖譜定量的方法，實(shí)現(xiàn)了對纖維素酶水

6、解過程中產(chǎn)生的纖維寡糖種類以及每種寡糖含量的隨時間過程的檢測和定量分析，克服了常規(guī)以終點(diǎn)還原端總量反應(yīng)纖維素酶活性方法的不足。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用該FACE技術(shù)可以快速區(qū)分纖維素酶系中的外切纖維素酶(CBH)、內(nèi)切纖維素酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(BG)等酶組分的類別，實(shí)現(xiàn)了纖維素酶種類與降解模式的快速確定。通過對不同內(nèi)切纖維素酶在水解無定形纖維素（RAC）的產(chǎn)物譜的定量分析，首次確認(rèn)了不同內(nèi)切纖維素酶的作用模式存在明顯差異。即使同一糖苷水解

7、酶家族(GH5)中，不同酶組分也有不同的降解模式。這一結(jié)果對于解釋纖維素降解微生物為什么能夠產(chǎn)生多組分內(nèi)切纖維素酶提供了一個直接的證據(jù)。同時該研究結(jié)果說明僅僅基于序列一致性對糖苷水解酶進(jìn)行分類可能是不夠的，不能充分說明不同糖苷水解酶功能上的差別。基于FACE技術(shù)表征不同纖維素酶降解模式的分析，可以為糖苷水解酶的功能分類，特別是內(nèi)切纖維素酶功能的進(jìn)一步分類及功能分析提供一個新的有力工具。
　　3、通過對瑞氏木霉4種內(nèi)切纖維素酶的動態(tài)

8、寡糖產(chǎn)物譜及其對活性中心生物信息學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)不同降解模式的內(nèi)切纖維素酶有其特定的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　對瑞氏木霉的EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ、EGⅣ四種內(nèi)切纖維素酶組分水解無定形纖維素和纖維寡糖的產(chǎn)物譜進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果表明不同內(nèi)切纖維素酶組分并非傳統(tǒng)上認(rèn)為的隨機(jī)結(jié)合并切斷無定型纖維素鏈，而是與外切纖維素酶相似，特定的內(nèi)切纖維素酶具有特征性產(chǎn)物譜。通過對這些酶組分對纖維寡糖水解的比較分析，發(fā)現(xiàn)每種內(nèi)切纖維素酶的最小寡糖的結(jié)合單元是不

9、同的:EGⅠ具有強(qiáng)的結(jié)合纖維三糖并降解的能力;EGⅡ可以結(jié)合并降解纖維三糖，但能力較EGⅠ弱;EGⅢ具有結(jié)合并降解纖維四糖的能力，EGⅣ具有結(jié)合并降解纖維五糖的能力。利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析技術(shù)，對具有結(jié)晶結(jié)構(gòu)的三種內(nèi)切纖維素酶(EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ)進(jìn)行了比較分析。通過生物信息學(xué)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，三種內(nèi)切纖維素酶催化活性部位的結(jié)構(gòu)、活性中心表面電勢都有較大的差別。對內(nèi)切纖維素酶與寡糖相互作用的π-H相互作用和氫鍵進(jìn)行了分析，確定了

10、每種內(nèi)切纖維素酶與寡糖相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，并對這些氨基酸殘基的分布進(jìn)行了分析，得出了與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致的結(jié)論。這說明同種微生物分泌的多種內(nèi)切纖維素酶具有不同的作用模式，應(yīng)有不同的生物學(xué)功能。
　　4、利用熒光光譜方法實(shí)現(xiàn)了纖維素酶與底物結(jié)合的動力學(xué)定量測定，為研究蛋白質(zhì)分子與糖分子配體之間的相互作用提供了一種可行的方法。利用該方法定量表征出以pNPC為底物檢測外切纖維素酶活性時會高估相應(yīng)催化活力。
　　纖維素酶可以特異

11、性識別并結(jié)合纖維素，其中活性中心的色氨酸等芳香族氨基酸殘基在底物識別過程起著重要作用。色氨酸殘基可以被295 nm的激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射355 nm的熒光，當(dāng)色氨酸殘基與糖分子等配體結(jié)合后會誘導(dǎo)電子軌道變化發(fā)生熒光淬滅，其淬滅強(qiáng)度與配體分子的結(jié)合量之間具有劑量效應(yīng)關(guān)系?；诖?，本研究利用熒光光譜方法對糖苷水解酶與底物結(jié)合的動力學(xué)過程進(jìn)行了定量分析。通過對淬滅曲線的單點(diǎn)/多點(diǎn)結(jié)合動力學(xué)曲線擬合分析，明確區(qū)分了糖苷水解酶單點(diǎn)特異性結(jié)合與多點(diǎn)非特

12、異性結(jié)合的定量關(guān)系，利用特異性結(jié)合區(qū)間定量測定了糖苷水解酶與底物結(jié)合過程動力學(xué)常數(shù)以及其自由能變化，同時定量分析了外切纖維素酶底物類似物對硝基苯β-D纖維二糖苷(pNPC)作為外切纖維素酶活性表征底物的局限性，發(fā)現(xiàn)以pNPC為底物檢測纖維素外切酶酶活時會有過高的正向偏差?；谏彼釟埢Y(jié)合配體熒光光譜的定量分析可以準(zhǔn)確分析糖苷水解酶與底物結(jié)合的動力學(xué)過程，有助于促進(jìn)蛋白質(zhì)與多糖相互作用的深入研究，可為研究蛋白質(zhì)分子與小分子配體之間的相互