瑞氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄因子功能及染色質(zhì)修飾在酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用研究.pdf

1、絲狀真菌是自然界中降解木質(zhì)纖維素的主要微生物類(lèi)別，其中瑞氏木霉（Trichoderma reesei，紅褐肉座菌Hypocrea jecorina的無(wú)性型）是最重要的代表菌株，其可以產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三類(lèi)不同的纖維素降解酶，其中外切纖維素酶CBHⅠ占瑞氏木霉分泌纖維素酶系的60％。研究表明，CBHⅠ基因的表達(dá)受到碳源的嚴(yán)格調(diào)控，在纖維素存在條件下，其表達(dá)量可提高1000倍以上，而在葡萄糖條件下，其表達(dá)被完全抑

2、制。目前，纖維素酶的高效誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制的研究尚處于探索階段。
　　 近幾年的研究工作主要集中于對(duì)主要纖維素酶基因的啟動(dòng)子活性進(jìn)行分析，分離鑒定了幾個(gè)與啟動(dòng)子相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，它們通過(guò)正調(diào)控與負(fù)調(diào)控的雙重控制機(jī)制調(diào)控纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。其中，Cre1是最早鑒定的與啟動(dòng)子相互作用的碳代謝抑制因子，可以結(jié)合在cbh1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游700bp的5‘-SYGGRG-3’反向重復(fù)序列上，Cre1的缺失導(dǎo)致在葡萄糖培養(yǎng)條件中發(fā)生去阻

3、遏。然而，Cre1并不參與所有纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，比如cbh2，xyn2及bgl1;隨后通過(guò)酵母單雜交體系獲得了轉(zhuǎn)錄因子Ace1和Ace2，體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明二者識(shí)別的共有序列分別為AGGCA和GGSTAATA，最初這兩個(gè)蛋白都被認(rèn)為具有轉(zhuǎn)錄激活活性，但后續(xù)試驗(yàn)表明，ace1缺失后xyn1及一些纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄水平提高，而ace2缺失后導(dǎo)致cbh1，cbh2，egl1及egl2轉(zhuǎn)錄mRNAs的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)降低，且誘導(dǎo)后期相關(guān)纖維素酶及X

4、yn2酶活降低30-70％;木聚糖酶調(diào)控因子X(jué)yr1是作為黑曲霉中轉(zhuǎn)錄因子X(jué)lnR的同源蛋白被得以鑒定識(shí)別，該基因的缺失造成包括cbh1，cbh2，egl1，xyn1與xyn2在內(nèi)的主要纖維素酶和半纖維素酶基因的不轉(zhuǎn)錄，是纖維素酶基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子。此外，體外實(shí)驗(yàn)表明Xyr1可結(jié)合到單獨(dú)或反向重復(fù)的GGC(A/T)3序列上。上述轉(zhuǎn)錄因子的鑒定以及對(duì)它們不同結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別，意味著纖維素酶基因的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄是一個(gè)多轉(zhuǎn)錄因子參與

5、、與順式調(diào)控元件相互作用的復(fù)雜過(guò)程。
　　 真核生物的染色體是由核小體組成的，核小體結(jié)構(gòu)過(guò)于緊密通常會(huì)阻礙RNA polⅡ的結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄，因此基因轉(zhuǎn)錄的激活除了需要轉(zhuǎn)錄激活因子與靶 DNA序列的結(jié)合外，啟動(dòng)子區(qū)域的局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、重構(gòu)和修飾也是必需的。這種染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化主要包括組蛋白的翻譯后修飾以及ATP-依賴(lài)的重構(gòu)復(fù)合物的形成。T.reesei是一種絲狀真菌，因此纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄也應(yīng)該存在這種控制機(jī)制。目前，已經(jīng)證實(shí)纖

6、維素酶基因cbh2的轉(zhuǎn)錄與核心啟動(dòng)子區(qū)的核小體定位和移除有關(guān)，但這種染色質(zhì)發(fā)生變化的機(jī)制目前未見(jiàn)報(bào)道。因此，本論文針對(duì)纖維素酶基因的高效表達(dá)機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究，包括組蛋白的乙酰化修飾和染色體重構(gòu)在纖維素酶基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄中的作用和機(jī)制，主要結(jié)果如下:
　　 一、分離鑒定了T.reesei中的一個(gè)乙酰化轉(zhuǎn)移酶基因Tr_gcn5，證明了該基因在碳源代謝、菌絲生長(zhǎng)、孢子形成及纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要功能
　　 Gcn5是在酵母中

7、發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白乙?；?，參與基因的轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程。本研究通過(guò)氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析首次在T.reesei中分離鑒定了酵母Gcn5的同源蛋白TrGcn5，并在酵母中通過(guò)功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明了該蛋白具有乙?；D(zhuǎn)移酶活性。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該基因在T.reesei中缺失后，菌株在不同碳源的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力下降，菌絲體的形態(tài)也發(fā)生了實(shí)質(zhì)性變化，最顯著的是缺失菌株基本喪失了孢子形成能力。除此以外，gcn5敲除菌株中主要的纖維素酶基因cbh1在誘導(dǎo)過(guò)

8、程中的轉(zhuǎn)錄一直維持在很低的水平，發(fā)酵液中也檢測(cè)不到相應(yīng)的纖維素酶活性。我們的結(jié)果顯示在T.reesei中，gcn5對(duì)基因組水平上的基因表達(dá)有廣泛的影響，參與了碳源代謝、菌絲生長(zhǎng)、無(wú)性生殖以及包括纖維素酶誘導(dǎo)在內(nèi)的壓力響應(yīng)過(guò)程。
　　 二、通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從全基因水平上考察了野生菌株和Δgcn5菌株在纖維素酶誘導(dǎo)過(guò)程中的基因轉(zhuǎn)錄差異，從而系統(tǒng)深入的分析了gcn5基因缺失對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)響應(yīng)、信號(hào)傳遞、能量合成、基礎(chǔ)代謝等途徑的影

9、響和可能的機(jī)制，為揭示纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了更詳盡的數(shù)據(jù)和較清晰的脈絡(luò)。
　　 分別提取同樣誘導(dǎo)條件下的野生菌株和Δgcn5菌株的RNA，分離mRNA后進(jìn)行全序列測(cè)定，對(duì)測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析歸類(lèi)后，得到了以下結(jié)果:(1)兩株菌響應(yīng)纖維素誘導(dǎo)條件的基因不同。野生菌株有703個(gè)基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，而Δgcn5菌株有804個(gè)基因轉(zhuǎn)錄上調(diào);有422個(gè)轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因重疊;分別占差異表達(dá)基因總數(shù)的31.5％和33.4％;說(shuō)明Δgcn5菌

10、株在誘導(dǎo)條件下有更多的基因表現(xiàn)為上調(diào)來(lái)回補(bǔ)gcn5缺失造成的影響;(2)表達(dá)差異的基因主要集中在碳水化合物的合成和分解代謝過(guò)程中。通過(guò)GO(Gene Ontology)顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，碳水化合物降解和代謝途徑差異較大，推測(cè)在該途徑中的影響是特異的。同時(shí)，由于gcn5的缺失對(duì)葡聚糖代謝的影響，造成了細(xì)胞壁合成的障礙，也妨礙了孢子的形成;(3)Δgcn5菌株中細(xì)胞骨架調(diào)控途徑中只有兩個(gè)基因上調(diào)，一個(gè)基因下調(diào)，但這種變化抑制了肌動(dòng)蛋白的合

11、成，這可以解釋菌絲的生長(zhǎng)和擴(kuò)散變?nèi)酰赡芤彩擎咦硬荒苄纬傻脑?(4)兩株菌的差異表達(dá)基因在氧化磷酸化，TCA循環(huán)和糖酵解途徑中都沒(méi)有表現(xiàn)出顯著富集，說(shuō)明gcn5的缺失并沒(méi)有影響胞內(nèi)的能量水平;(5)主要的纖維素酶基因以及轉(zhuǎn)錄激活因子X(jué)yr1在gcn5的缺失的情況下都不能轉(zhuǎn)錄，這種影響途徑是特異的;(6)在Δgcn5菌株中一共發(fā)現(xiàn)了三個(gè)具有乙?；富钚缘奈粗鞍壮霈F(xiàn)轉(zhuǎn)錄上調(diào)，部分回補(bǔ)了由于gcn5缺失造成的影響。
　　 三、通過(guò)

12、優(yōu)化條件，改進(jìn)了T.reesei的染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù);進(jìn)一步分析了誘導(dǎo)過(guò)程中主要纖維素酶基因啟動(dòng)子上的組蛋白乙?；兓?br>　　 經(jīng)典的染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）多以哺乳動(dòng)物細(xì)胞或酵母菌為基礎(chǔ)建立，T.reesei為絲狀真菌，對(duì)ChIP結(jié)果準(zhǔn)確性的可能造成影響的因素不明確，因此我們對(duì)通過(guò)逐一考察ChIP實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)經(jīng)典的染色體免疫共沉淀的技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果為:甲醛交聯(lián)的時(shí)間確定為10 min，菌體震蕩破碎的最佳

13、條件為200μl菌體+200μl破碎珠+500μl裂解液，5000 rpm20s運(yùn)行3次，全細(xì)胞破碎液離心之后用35％的超聲破碎功率進(jìn)行破碎，同時(shí)確定了細(xì)胞裂解液中去污劑的成分及濃度。通過(guò)優(yōu)化條件，發(fā)現(xiàn)T.reesei中ChIP關(guān)鍵的控制點(diǎn)為甲醛交聯(lián)時(shí)間和染色體的破碎程度，對(duì)結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性最重要。
　　 為了驗(yàn)證優(yōu)化和改進(jìn)的ChIP方法的可行性，我們選取了可以有效識(shí)別T.reesei組蛋白H4和H3乙酰化的抗體，研究了T

14、.reesei纖維素酶基因cbh1的轉(zhuǎn)錄曲線(xiàn)，對(duì)cbh1和cbh2基因在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄時(shí)啟動(dòng)子上組蛋白的乙?；竭M(jìn)行了檢測(cè)，證實(shí)了該技術(shù)方案可在T.reesei中應(yīng)用。為深入研究纖維素酶基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄時(shí)啟動(dòng)子上組蛋白的乙酰化的變化和染色質(zhì)的重構(gòu)，以及這些變化與纖維素酶基因高效轉(zhuǎn)錄之間的關(guān)系奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 四、闡明了啟動(dòng)子區(qū)核小體組蛋白的乙酰化水平是影響纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄的重要因素，而乙酰化酶Gcn5通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子xyr1基因

15、啟動(dòng)子上組蛋白的乙?；揭约昂诵◇w的丟失來(lái)影響xyr1基因的轉(zhuǎn)錄，從而進(jìn)一步調(diào)控纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄
　　 首先分析了不同的誘導(dǎo)碳源的培養(yǎng)條件下，野生型和Δgcn5菌株中cbh1基因啟動(dòng)子的乙酰化水平，發(fā)現(xiàn)前者誘導(dǎo)條件下cbh1基因啟動(dòng)子區(qū)乙?；讲煌潭忍岣?，而后者始終維持在非誘導(dǎo)水平;推測(cè)乙?；乃?jīng)Q定著纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，因此又構(gòu)建了組蛋白持續(xù)乙?；?Q)和非乙?；?R)的突變體，進(jìn)一步證實(shí)了組蛋白乙酰化水平變化能

16、夠影響纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)檢測(cè)纖維素酶基因通用的轉(zhuǎn)錄激活因子xyr1基因的轉(zhuǎn)錄水平時(shí)發(fā)現(xiàn)其在Δgcn5菌株中喪失轉(zhuǎn)錄。在其他組蛋白突變體中，其轉(zhuǎn)錄水平都受到不同程度的影響，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，xyr1轉(zhuǎn)錄水平的高低對(duì)應(yīng)著cbh1基因轉(zhuǎn)錄水平的高低，因此，我們又研究了Δxyr1菌株中cbh1基因啟動(dòng)子的乙?；?，發(fā)現(xiàn)xyr1的缺失也影響了乙?；?。因此我們推測(cè)xyr1的轉(zhuǎn)錄受到其自身啟動(dòng)子的乙?；降挠绊?，一旦Xyr1結(jié)合到纖維素酶基因啟動(dòng)

17、子，又會(huì)征募組蛋白乙?；笍?fù)合物，引起纖維素酶基因啟動(dòng)子上的乙?；降淖兓瑥亩{(diào)控轉(zhuǎn)錄。
　　 綜合以上結(jié)果我們可以推測(cè)Gcn5參與的組蛋白乙酰化與纖維素酶基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄之間之間的關(guān)系模式圖:在纖維素酶誘導(dǎo)過(guò)程中，首先乙酰化酶Gcn5通過(guò)改變xyr1基因啟動(dòng)子上組蛋白的乙?；剑瑓⑴c了xyr1基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程;當(dāng)xyr1轉(zhuǎn)錄翻譯后便結(jié)合到cbh1基因啟動(dòng)子上，開(kāi)始征募Gen5乙?；笍?fù)合物，進(jìn)而又使cbh1啟動(dòng)子上組蛋白的乙酰

18、化水平提高，從而引起轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的暴露，有利于RNA聚合酶的結(jié)合而起始轉(zhuǎn)錄。
　　 五、通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子X(jué)yr1與纖維素酶基因啟動(dòng)子的相互作用以及轉(zhuǎn)錄激活性質(zhì)進(jìn)行了分析
　　 自纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄因子Ace1，Ace2和Xyr1被相繼鑒定后，已報(bào)道的結(jié)果主要集中于通過(guò)遺傳學(xué)手段研究這些基因缺失后對(duì)纖維素酶基因表達(dá)的影響，以及通過(guò)體外凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)在體外證明了這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可明顯結(jié)合特定的DNA序列。

19、但是關(guān)于這些蛋白在體內(nèi)與纖維素酶基因啟動(dòng)子相互作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們分別選取包含Xyr1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和激活結(jié)構(gòu)域(AD)的不同長(zhǎng)度的DNA序列，導(dǎo)入含有不同啟動(dòng)子控制的報(bào)告基因的釀酒酵母中，通過(guò)酵母單雜交體系來(lái)研究Xyr1與DNA的相互作用，并試圖對(duì)其AD結(jié)構(gòu)域定位。結(jié)果表明，在釀酒酵母中Xyr1的DBD區(qū)不能有效的結(jié)合cbh1啟動(dòng)子，同時(shí)其AD區(qū)也沒(méi)有表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄激活活性，可能有以下原因:1）Xyr1

20、 DBD與Gal4 AD的雜合蛋白在釀酒酵母中折疊錯(cuò)誤或其它原因?qū)е碌鞍撞环€(wěn)定，進(jìn)而影響了其功能;2）雜合蛋白封閉了Xyr1與DNA相互作用的位點(diǎn);3）雜合蛋白在釀酒酵母中不能準(zhǔn)確地定位到細(xì)胞核內(nèi)，導(dǎo)致無(wú)法與靶DNA結(jié)合。此外，研究還發(fā)現(xiàn)米曲霉中的轉(zhuǎn)錄因子X(jué)lnR(Xyr1的同源蛋白)與靶DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活能力有效發(fā)揮的前提是該蛋白發(fā)生磷酸化修飾，而構(gòu)巢曲霉中參與氨代謝的轉(zhuǎn)錄因子NirA（鋅核雙簇蛋白）的定位和與DNA的結(jié)合需要GAT