白腐真菌多功能過氧化物酶基因克隆表達(dá)研究.pdf

1、白腐真菌對(duì)木質(zhì)素的有效降解主要依賴于一系列木質(zhì)素降解酶系，其中多功能過氧化物酶Versatile peroxidase（VP）是一類含亞鐵血紅素的過氧化物酶，它兼具木質(zhì)素過氧化物酶Lignin peroxidase（LiP）和錳過氧化物酶Manganese peroxidase（MnP）兩者的特性，在木質(zhì)纖維素生物預(yù)處理、染料脫色、污染物降解轉(zhuǎn)化等方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值和潛能。因此，發(fā)掘多功能過氧化物酶基因資源、構(gòu)建高效表達(dá)體系及探索其

2、表達(dá)調(diào)控規(guī)律，有助于深入揭示白腐菌降解木質(zhì)素的機(jī)制及其應(yīng)用研究?；诖?，本論文對(duì)白腐真菌Physisporinus sp.P18的多功能過氧化物酶基因進(jìn)行克隆，異源及誘導(dǎo)表達(dá)研究，獲得主要結(jié)論如下：
　　對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的P18菌株進(jìn)行分子生物學(xué)屬性鑒定，將其歸為亞臥孔菌屬，命名為Physisporinus sp.P18。并對(duì)其產(chǎn)酶規(guī)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Mn2+可促進(jìn)Physisporinus sp.P18胞外VP等Mn2+依賴過氧化物酶酶

3、活水平，0~1mM的范圍內(nèi)，M n2+濃度越高，促進(jìn)作用越明顯。
　　進(jìn)一步采用簡(jiǎn)并PCR和基因組步移技術(shù)獲取了VP1和VP2全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。其中VP1和VP2全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)基因分別為1669bp和1651bp，去除內(nèi)含子后的編碼序列長(zhǎng)1077bp，編碼358個(gè)氨基酸（兩者同源性88％）；預(yù)測(cè)編碼的多功能過氧化物酶含有21個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽，去除信號(hào)肽的成熟蛋白分子量分別為36.83KD和35.79KD，等電點(diǎn)分別為

4、4.54和4.35。
　　通過熒光定量PCR的方法研究了Mn2+對(duì)Physisporinus sp.P18多功能過氧化物酶基因轉(zhuǎn)錄水平的促進(jìn)作用，初步探索了Mn2+對(duì)多功能過氧化物酶的表達(dá)影響規(guī)律。150~500μM的低濃度范圍內(nèi)，Mn2+對(duì)Physispo rinus sp.P18VP1~3轉(zhuǎn)錄水平有顯著促進(jìn)作用，但對(duì)不同VP基因的最佳促進(jìn)濃度不相同，分別在150、300、500μM的濃度下對(duì)VP1~3有4.0、3.5、3.8倍

5、的最佳促進(jìn)作用；當(dāng)M n2+增加到1000、1500μM的高濃度時(shí)，對(duì)VP3仍分別有2.3和3.7倍的顯著促進(jìn)作用。
　　構(gòu)建了Physisporinus sp.P18-rVP1基因表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)，通過對(duì)重組蛋白包涵體的復(fù)性重折疊獲取活性蛋白，再經(jīng)鎳柱分離，最終純化酶蛋白rVP1得率為18mg/L，比酶活為23.1U/mg，研究其酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果顯示：重組多功能過氧化物酶rVP1以M n2+為底物時(shí)，最適反應(yīng)pH為5.0，

6、最適反應(yīng)溫度為40°C；M n2+可影響rVP1對(duì)其他底物的動(dòng)力學(xué)常數(shù)；rVP1對(duì)中性和堿性環(huán)境、多數(shù)金屬離子以及對(duì)酶抑制劑中的SDS耐受性較好。在pH5.0和Mn2+存在時(shí)，rVP1對(duì)5種不同結(jié)構(gòu)類型的染料均有較強(qiáng)脫色作用，并能有效催化工業(yè)堿木素和天然木質(zhì)素EMAL。
　　綜上所述，本論文獲取了白腐真菌Physisporinus sp.P18多功能過氧化物酶基因資源，初步研究了Mn2+對(duì)多功能過氧化物酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的誘導(dǎo)作用，構(gòu)建了