計算機輔助分子設計提高蛋白質熱穩(wěn)定性的研究.pdf

1、酶作為天然的生物催化劑,具有高催化效率和高底物選擇特異性的特點,在工業(yè)生產(chǎn)上擁有巨大的應用潛力和良好的發(fā)展前景。但是許多酶分子對工業(yè)生產(chǎn)中熱處理的耐受性較差,嚴重制約了它們在工業(yè)生產(chǎn)中的應用。因此研究蛋白質的熱穩(wěn)定機制與通過理性設計提高蛋白質的熱穩(wěn)定性一直是計算生物學及蛋白質工程領域中的一個研究熱點。這對擴大酶的應用范圍與探究蛋白質結構和功能的關系均具有重要意義。
　　 本研究中我們設計了兩個策略分別從微觀與宏觀兩方面分析確定了

2、影響蛋白質熱穩(wěn)定性的關鍵氨基酸,并以來源于Ochrobactrum sp.M231的甲基對硫磷水解酶(MPH-Ochr)為研究對象,利用實驗來驗證設計策略的有效性。
　　 策略一為創(chuàng)新性的將分子動力學模擬應用到蛋白質熱穩(wěn)定性的研究中。其計算步驟主要包括首先利用分子動力學模擬來尋找蛋白質活性中心以外的構象不穩(wěn)定區(qū)段,查找構象不穩(wěn)定區(qū)段內(nèi)部或其附近的柔性氨基酸(如甘氨酸),并將這些柔性氨基酸突變?yōu)閯傂园被?如脯氨酸),再利用分子動

3、力學模擬來驗證這些突變對構象不穩(wěn)定區(qū)段的影響,即對蛋白質熱穩(wěn)定性的影響。將該策略應用到MPH—Ochr,首先通過分子動力學模擬發(fā)現(xiàn)在該酶的第186-193位氨基酸的構象非常不穩(wěn)定,并且這些氨基酸不在蛋白質的活性中心,經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)在該區(qū)段的下游存在兩個甘氨酸(G194及G198),通過同源模建模擬了三個突變體(G194P,G194P／G198P及G198P)的三維結構,再利用分子動力學模擬來驗證這些突變的效果,發(fā)現(xiàn)只有突變G194P能明

4、顯提高區(qū)段186—193的構象穩(wěn)定性。將野生型與三個突變體的基因進行表達、蛋白質純化并測定各自的熱穩(wěn)定性,實驗結果與計算結果基本一致,G194P的Tm值與750分別比野生型提高了3.3℃與4.6℃。熱動力學數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)G194P的焓變和野生型相當,但其熵變比野生型更低,這表明其受熱處理時構象更加穩(wěn)定。這些實驗結果表明該策略是有效的針對蛋白質進行熱穩(wěn)定性改造的分子設計方法。
　　 策略二為通過計算突變體和野生型蛋白質解折疊自由能的

5、差值(△△G)和其正負類別來篩選可能會影響蛋白質熱穩(wěn)定性的位點。在本研究中我們設計了新的一個基于蛋白質結構的預測突變對蛋白質熱穩(wěn)定性影響的具體數(shù)值(即:△△G值)和其正負類別的軟件Prethermut。該軟件有兩個主要的特征,其一為它可以預測單點與多點突變對蛋白質熱穩(wěn)定性的影響；其二為首次在特征設計的過程中引入了一個蛋白質標準特征,將突變體的結構特征和這個蛋白質標準特征進行比較,而不是直接將突變體的結構特征和野生型蛋白質的結構特征進行比

6、較。用數(shù)據(jù)集S-dataset來測試該軟件的性能,并將其與一些常用的類似軟件進行比較,結果表明該軟件無論是分類預測的能力還是回歸預測的能力均優(yōu)于已有的常用軟件。
　　 我們同樣將該策略應用于MPH-Ochr來提高該酶的熱穩(wěn)定性并檢驗該策略的有效性。利用蛋白質的位點進化熵(E),Prethermut的分類預測結果以及回歸預測結果,篩選到可能不影響該酶的功能但可能會改善其熱穩(wěn)定性的7個氨基酸位點。在這7個位點構建定點飽和突變體庫,從

7、中篩選出陽性克隆,再評估突變對蛋白質熱穩(wěn)定性的影響,結果表明有6個突變體庫均可以篩選得到熱穩(wěn)定性較野生酶提高的突變體。這些實驗結果表明利用該策略篩選影響蛋白質熱穩(wěn)定性位點的方法是行之有效的。
　　 根據(jù)篩選到的6個突變體庫中的單點突變信息,進行多點組合突變。組合突變的策略為先將篩選突變體文庫獲得的6個突變體按照熱穩(wěn)定性提高程度進行排序,然后在最優(yōu)的單點突變體的基礎上進行雙點突變(突變位點為熱穩(wěn)定性第二優(yōu)的突變位點),然后在最優(yōu)的